基于SSR分子標記的73份山葡萄及雜交后代的遺傳多樣性分析

王衍莉 楊義明 范書田 趙瀅 許培磊 路文鵬 李昌禹

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

山葡萄（Vitis amurensisRupr）又名東北山葡萄，是葡萄科落葉藤本植物，是葡萄屬中最抗寒的種，其野生資源主要分布于我國東北、俄羅斯遠東和朝鮮半島。在東北地區(qū)山葡萄是釀造葡萄酒的主要原料［1-2］。近年的研究還發(fā)現(xiàn)其山葡萄果實中含有18種游離氨基酸，富含豐富的白藜蘆醇和花色素苷等成分，是抗氧化、防癌的有效成分，可用于保健品和化妝品的研發(fā)［3-4］。過去由于野生山葡萄生存環(huán)境的破壞，導(dǎo)致山葡萄漿果蘊藏量，山葡萄遺傳多樣性不斷下降，為了擴大山葡萄產(chǎn)量，提高山葡萄品質(zhì)，豐富山葡萄資源的遺傳多樣性，20世紀60年代研究人員對野生山葡萄資源進行資源收集、家植馴化、雜交育種獲得了許多具有優(yōu)良性狀的山葡萄資源，以發(fā)現(xiàn)的兩性花山葡萄“雙慶”為親本，選育了抗性較強的釀酒品種“北冰紅”、“左優(yōu)紅”等［5］。目前不同山葡萄品種間的果實產(chǎn)量和品質(zhì)仍存在較大差異，了解不同品種山葡萄的遺傳背景，引進具有優(yōu)良性狀的山葡萄品種，有目的地選擇育種親本培育優(yōu)質(zhì)新品種，豐富山葡萄種質(zhì)資源依然是山葡萄栽培利用研究的重要內(nèi)容之一［6-7］。

SSR分子標記技術(shù)因其共顯性遺傳、多態(tài)性位點多、信息含量豐富并且所需DNA量少，目前廣泛被用于分子標記開發(fā)、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、數(shù)量性狀基因座（QTL）分析、基因定位、親緣關(guān)系鑒定等［8-9］。本研究利用SSR分子標記技術(shù)分析團隊從俄羅斯引進的葡萄栽培品種和野生葡萄資源與東北山葡萄選育品種之間的遺傳差異，明確種質(zhì)間的親緣關(guān)系和遺傳分化程度，旨在為山葡萄資源評價、良種選育及分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取葡萄植株新稍上大小約2 cm2的葉片，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｆ咸奄Y源信息見表1。

植物DNA提取相關(guān)試劑購自上海生工，生工植物基因組提取試劑盒，三氯甲烷，無水乙醇，異丙醇。

所用儀器有JY-CZ-BL電泳儀，Biorad-PCR擴增儀，紫外分光光度計，Biorad凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用生工植物基因組提取試劑盒，提取山葡萄基因組DNA，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量。將質(zhì)量合格的基因組DNA放入-20℃冰箱保存。

1.2.2 SSR引物篩選 選取“雙慶”、“雙豐”、“北國藍”、RS1201、RS1402、RS1509、RS1801和RS-1807的DNA為模板，根據(jù)石廣麗［6］的山葡萄PCR體系反應(yīng)程序，對30對SSR引物進行篩選，選擇擴增條帶清晰且具有多態(tài)性的引物，用于73份葡萄資源的遺傳多樣性分析，引物信息見表2。

表1 73份葡萄材料的信息

1.2.3 73份葡萄資源的PCR擴增及丙烯酰胺凝膠電泳檢測 根據(jù)石廣麗［6］的PCR擴增反應(yīng)體系優(yōu)化后的反應(yīng)體系（16 μL）：上下游引物（5 μmol/L）各0.3 μL，2×Taq PCR StarMix 8 μL，基因組DNA 1.5 μL，ddH2O 5.9 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 40 s，59℃-63℃復(fù)性 40 s，72℃延伸 40 s，共30個循環(huán)；72℃延伸 7min。

表2 11對引物信息

擴增產(chǎn)物用6%的變性丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳電壓250 V，時間2.5 h，采用銀染法，對丙烯酰胺凝膠進行染色，拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用0、1二元數(shù)據(jù)記錄SSR條帶，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，數(shù)據(jù)缺失記為“9”，應(yīng)用NTsys軟件對73份山葡萄材料進行聚類分析，使用POPGENE32軟件計算觀察等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne、引物多態(tài)性信息含量PIC、觀測期望雜合度He、Shannon信息指數(shù)I、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)，遺傳分化系數(shù)Fst以及群體的遺傳距離和遺傳相似性。

2 結(jié)果

2.1 山葡萄及雜交后代的PCR擴增

30對SSR引物中共篩選出11對擴增條帶清晰且具有多態(tài)性的引物。11對多態(tài)性SSR引物對73份山葡萄及雜交后代進行PCR擴增，經(jīng)丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 部分SSR位點的PCR擴增結(jié)果

2.2 山葡萄及雜及雜交后代的SSR遺傳多樣性分析

使用POPGENE32對11對SSR引物的擴增結(jié)果進行分析，分析結(jié)果見表3。11對引物共擴增到75個等位基因，每個位點擴增3（VVIN31）-10（VVS2）個等位基因，平均等位基因6.8182個，各位點多態(tài)性信息含量（PIC）變化范圍為0.2337（VVIN31）-0.8098（VVS2）表明VVIN31、VMCA12位點只具有低中度多態(tài)性，其余9個位點都具有高度多態(tài)性；有效等位基因（Ne）在5.280（VVS2）-1.3050（VVIN 31）之間，平均值為3.5196，與觀察到的等位基因數(shù)存在著較大的差距，說明等位基因在群體內(nèi)的分布不均勻；基因多樣性指數(shù)（I）范圍1.8830（VVS2）-0.4678（VVIN31），平均值1.3736；Nei’s遺傳多樣指數(shù)在0.8098（VVS2）-0.2337（VVIN31）之間，平均值0.6444，以上指標在群體內(nèi)存在較大差異，表明不同位點的遺傳變異差異較大；觀測雜合度變化范圍為0.1667-0.9315，平均值0.4642，期望雜合度變化范圍0.8154-0.2353，平均值為0.6489，不同位點雜合度差異較大，平均觀測雜合度低于期望雜合度，表示種群內(nèi)存在一定的近交率，雜合子缺失，純合性比較高。

表3 11個SSR位點的遺傳變異和雜合性

2.3 種質(zhì)間親緣關(guān)系及遺傳分化分析

應(yīng)用Ntsys軟件分析73份種質(zhì)的遺傳距離和遺傳相似性，73份種質(zhì)的遺傳聚類變化范圍01.708，遺傳相似系數(shù)為0.68-1.0表明各種質(zhì)間親緣關(guān)系差異較大，根據(jù)遺傳相似系數(shù)對73份種質(zhì)做聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖可知，相似系數(shù)0.690處，73份山葡萄及雜交后代聚為2類，俄羅斯選育葡萄品種RS1402、RS1403、RS1404、RS1405、RS1410、RS1511聚為Ⅰ類，在相似系數(shù)0.711處73份葡萄資源被分為3大類，第Ⅱ類包含1份從俄羅斯引種的“哈?！?、東24-13-1和10份俄羅斯葡萄品種RS1201、RS1202、RS1203、RS1204、RS1401、RS1406、RS1407、RS1408、RS1409以及1份俄羅斯野生葡萄資源RS1819，第Ⅲ類包含山葡萄選育品種9份和45份俄羅斯野生葡萄資源。采用F統(tǒng)計法，分析73份山葡萄及雜交后代資源的遺傳變異及基因流，分析結(jié)果見表4。由表4可知群體內(nèi)的平均近交系數(shù)為0.1777，整個群體近交系數(shù)為0.2753，表示群體雜合子缺失，遺傳分化系數(shù)為0.1183，基因流為1.8641，表明群體間遺傳中度分化，基因流較豐富。

2.4 多樣性在不同種質(zhì)類型的葡萄資源間的分布

將73份山葡萄及雜交后代資源按照種質(zhì)類型分成3個群體：山葡萄選育品種、俄羅斯選育葡萄品種、俄羅斯野生葡萄品種進行多樣性分析，結(jié)果（表5）發(fā)現(xiàn)，3個群體中俄羅斯野生葡萄品種的等位基因數(shù)最高，山葡萄選育品種的等位基因最少；期望雜合度表明俄羅斯選育葡萄品種的雜合度最高，并且根據(jù)Shannon信息指數(shù)和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)都表明俄羅斯選育的葡萄品種有更高的遺傳多樣性。3個群體的遺傳距離數(shù)據(jù)見表6，結(jié)果表明山葡萄選育品種與俄羅斯野生葡萄品種的遺傳距離更近，俄羅斯選育葡萄品種與前2個群體的遺傳距離較遠，這與73份葡萄資源的聚類分析結(jié)果基本一致，說明山葡萄選育品種與俄羅斯野生葡萄品種的相似性更高，親緣關(guān)系更近。

表4 位點的F統(tǒng)計量和基因流

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，遺傳多樣性是指種內(nèi)不同居群之間或者一個居群內(nèi)的不同個體之間的遺傳變異的總和。一個物種的遺傳多樣性能夠反映該物種在特定環(huán)境中的基因豐富程度，了解一個物種的遺傳多樣性，對種質(zhì)資源的評價、保護和利用、創(chuàng)新提供重要依據(jù)［10-11］。遺傳多樣性評價參數(shù)能夠反映種內(nèi)不同居群之間及居群內(nèi)不同個體之間的遺傳變異水平，多態(tài)信息含量（PIC）反映SSR位點變異程度，數(shù)值越大，變異越多；觀測等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)反映等位基因分布的均勻程度，2個指標越接近，說明等位基因分布越均勻；Fis、Fit表示群體近交系數(shù)，數(shù)值大于零，表示居群內(nèi)純合體多，反之則雜合體過量［12-14］。

表5 不同群體的葡萄資源的遺傳變異和雜合性

表6 群體遺傳距離和遺傳相似系數(shù)

SSR分子標記技術(shù)能夠揭示葡萄不同種質(zhì)間的遺傳差異及親緣關(guān)系［15］。張子龍［16］利用SSR分子標記分析了14個釀酒葡萄品種的親緣關(guān)系，并通過不同引物組合鑒定了14個釀酒葡萄品種；張萌［17］用15對SSR引物分析79份葡萄資源的親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn)，中國野生葡萄資源與歐亞種和歐美雜交種葡萄親緣關(guān)系較遠，同時用8對引物分析黃山、湖南和福建地區(qū)的刺葡萄資源的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)黃山地區(qū)刺葡萄遺傳差異較少，刺葡萄基因流限制于短距離。溫景輝等［18］利用19對SSR引物對20個葡萄品種聚類分析，發(fā)現(xiàn)歐亞種與美洲種葡萄親緣關(guān)系較近，山葡萄與歐亞種和美洲種的親緣關(guān)系較遠；方連玉等［19-20］利用11對SSR引物分析15個葡萄品種的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，山葡萄與山歐雜交葡萄品種聚為一類，而美洲葡萄和歐亞種葡萄聚為一類，本研究的聚類結(jié)果與之相似。楊航宇等［21］利用6對SSR引物很好地區(qū)分了43份釀酒葡萄品種和鮮食葡萄品種，聚類結(jié)果并也證實葡萄種群的形成與其起源地的地理位置和氣候環(huán)境有著密切的關(guān)系。

圖2 73份山葡萄及雜交后代聚類分析結(jié)果

遺傳距離和遺傳一致性反映群體親緣關(guān)系，親緣關(guān)系越近，遺傳距離越小，遺傳一致性越大［13-14］，本研究中東北山葡萄與俄羅斯野生葡萄資源的遺傳距離為0.2146，小于東北山葡萄選育品種與俄羅斯山葡萄選育品種之間的遺傳距離0.5422，也小于俄羅斯選育品種與俄羅斯野生資源間的遺傳距離0.3716。這說明俄羅斯野生葡萄資源和東北山葡萄的遺傳差異較小，親緣關(guān)系較近，應(yīng)該是由于俄羅斯海參崴地區(qū)與中國東北地區(qū)地理位置較近，氣候環(huán)境比較相似。本研究分析不同居群間的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)東北選育山葡萄資源的等位基因數(shù)在2-5個，低于俄羅斯選育葡萄品種（3-7個）和俄羅斯野生葡萄資源（2-8個），這證實了吳子龍等［22-23］的研究結(jié)果：東北山葡萄中的等位基因數(shù)目一般在2-4個。3個群體的俄羅斯選育葡萄品種的平均期望雜合度0.6887和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)最高，表明這一群體的遺傳多樣性更加豐富，而東北山葡萄選育品種的各項指標都最低，這應(yīng)該是由于東北山葡萄分布區(qū)域較小，群體數(shù)少，群體內(nèi)基因交流缺乏的原因。2007年，吳子龍［7］對黑龍江、吉林、遼寧地區(qū)的野生葡萄資源做過遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑龍江野生葡萄資源的平均有效等位基因2.4499個，期望雜合度0.5585，吉林野生葡萄資源的平均有效等位基因2.4452個，期望雜合度0.5475，遼寧野生葡萄資源的平均有效等位基因2.3632個，期望雜合度0.53873，而本研究中的俄羅斯野生葡萄資源的有效等位基因2.9847，期望雜合度0.5850，說明俄羅斯野生葡萄資源的遺傳多樣性要高于東北地區(qū)的野生葡萄資源。下一步應(yīng)結(jié)合不同葡萄品種的農(nóng)藝性狀對俄羅斯選育葡萄資源的遺傳背景做進一步分析，為山葡萄種質(zhì)利用與創(chuàng)新提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究所用11對SSR引物具有豐富的多態(tài)信息。73份山葡萄及雜交后代聚為3類。3個群體的群體內(nèi)純合體過量，雜合體缺失，群體間存在中度遺傳分化，基因交流較豐富。東北山葡萄選育品種與俄羅斯野生葡萄資源的遺傳距離最近，親緣關(guān)系較近，與俄羅斯選育葡萄品種的親緣關(guān)系較遠，俄羅斯選育葡萄品種的遺傳多樣性豐富。