騰沖雪雞mtDNA D-loop 區(qū)遺傳多樣性分析*

王榮瓊 ，張自芳，黃 靜，錢林東，滕曉紅，苗永旺

(1.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650212；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

騰沖雪雞(Tengchong White Chicken)因主產(chǎn)于云南西部的騰沖市且全身羽毛雪白而得名，屬肉蛋兼用型地方雞種[1-2]。該雞分布于騰沖市高黎貢山西麓的界頭、曲石、五合、芒棒、明光和滇灘等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，中心產(chǎn)區(qū)在界頭和曲石2 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)[1]。產(chǎn)地與緬甸北部接壤，屬高黎貢山西麓的丘陵和山區(qū)地帶，地形地貌復(fù)雜，海拔在1 400～2 500 m 之間；當(dāng)?shù)厥苊霞永瓰澄髂吓瘽駳饬饔绊?，呈現(xiàn)典型的立體氣候特征。騰沖雪雞產(chǎn)地森林覆蓋率70%以上，草地、草山和林地甚多，農(nóng)副產(chǎn)品和飼料資源豐富[1-2]，為騰沖雪雞遺傳資源的形成和養(yǎng)殖提供了必要條件。據(jù)考證，騰沖雪雞在當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)已有幾百年的歷史；該雞是在當(dāng)?shù)馗呃柝暽轿髀椽毺氐淖匀画h(huán)境和生態(tài)條件下，與外界長期隔離和閉鎖繁育，經(jīng)當(dāng)?shù)厝嗣耖L期的選育形成的[1]。

騰沖雪雞以放養(yǎng)為主，體型中等，結(jié)實緊湊；羽色潔白如雪；皮膚、肌肉和骨骼均為烏色；冠多為單冠，少數(shù)玫瑰冠[1-2]。該雞對當(dāng)?shù)刈匀簧鷳B(tài)條件有良好的適應(yīng)性，具有耐粗飼、肉和蛋品質(zhì)佳、抗病力強等優(yōu)良種質(zhì)特性，是發(fā)展云南養(yǎng)雞業(yè)的寶貴遺傳資源[1-2]。騰沖雪雞是在1995—1997 年全國畜禽遺傳資源補充調(diào)查時被發(fā)現(xiàn)的[2-3]，于2011 年列入《中國畜禽遺傳資源志·家禽志》[1]，2015 年列入《云南省畜禽遺傳資源志》[1]。

近年對騰沖雪雞的種質(zhì)特性已有研究報道，已對該雞的產(chǎn)地和分布、體型外貌特征、血液生化指標(biāo)和屠宰性能等有所描述[1-5]。過去采用微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記對該雞進行了群體遺傳多樣性研究[6-7]，但距今已有10 余年的時間，現(xiàn)在該雞的群體遺傳結(jié)構(gòu)如何？外來雞種對其有無基因滲入？急需進一步對其進行分子水平的遺傳評估和遺傳監(jiān)測。本研究利用適合進行種下水平遺傳多樣性分析的mtDNA D-loop 區(qū)序列為遺傳標(biāo)記[8-13]，采用 PCR 產(chǎn)物直接測序技術(shù)，并以云南本地其他地方雞種為對照，對騰沖雪雞樣品進行群體變異檢測和群體遺傳學(xué)分析，闡明了該雞的群體遺傳結(jié)構(gòu)和血統(tǒng)組成，揭示該雞群體與云南其他本地雞種存在一定遺傳差異。本研究結(jié)果可為騰沖雪雞資源的保種和育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

在云南省騰沖市的界頭、曲石、五合和芒棒等鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集了144 只騰沖雪雞(♂：60，♀：84)的血液樣品，每只雞采靜脈血1 mL。由當(dāng)?shù)匦竽敛块T專家?guī)ьI(lǐng)采樣，要求具備騰沖雪雞典型的品種特征、無血緣關(guān)系且在分布上具有代表性。

為了更好地評價騰沖雪雞的遺傳多樣性狀況，本實驗室已發(fā)表的11 個云南地方雞群體的647 條mtDNA D-loop 區(qū)序列用于與本研究數(shù)據(jù)進行比較分析[14-19]。

1.2 基因組DNA 的提取

采用酚—氯仿提取法提取基因組DNA，具體方法參照LIU 等[11]的方法。然后，使用Nano-Drop 2000UV-VIS 分光光度計(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)測定其質(zhì)量濃度和純度，稀釋成100 ng/μL。

1.3 目的片段擴增及序列測定

目的片段擴增及測序所需引物相同，參照FUMIHITO 等[9]的方法，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 體系及操作程序參照LIU 等[11]。PCR 產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向直接測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所獲序列經(jīng)人工檢查核對后，以.seq 格式輸出，利用ClustalX 軟件進行比對，再采用DnaSP 6 軟件進行DNA 序列分析，包括群體多態(tài)位點、多態(tài)性、基因流、群體間遺傳分化和遺傳距離等的計算和輸出。用MEGA 6 軟件估算整個群體的平均遺傳多樣性，進行單倍型輸出和世系的劃分，并采用鄰接法(neighbor-jointing,NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異分析

本研究擴增片段長539 bp，為家雞mtDNA D-loop 區(qū)第1 高變區(qū)序列。去掉兩側(cè)測序質(zhì)量較差的序列后，用于本研究的序列長度為520 bp。序列中T、C、A 和G 平均含量分別為30.2%、29.8%、27.3% 和12.6%；序列A+T 平均含量為57.6%，符合mtDNA 序列特征。序列中共檢測到33 個多態(tài)位點，約占檢測核苷酸位點總數(shù)的6.35%，未發(fā)現(xiàn)插入/缺失，核苷酸替換主要為轉(zhuǎn)換；轉(zhuǎn)換占1.54%，顛換占0.19%，轉(zhuǎn)換顛換比R 值為9.34。在發(fā)現(xiàn)的33 個多態(tài)位點中，包含單一信息位點4 個，簡約信息位點29 個。群體中共發(fā)現(xiàn)21 種單倍型，其中單倍型H02、H03、H08 和H11 在群體中所占比例較多，單倍型頻率分別為18.75%，18.75%，11.81%和13.19%。本研究所檢測到的突變位點及各單倍型包含的變異位點信息見圖1。

圖1 騰沖雪雞mtDNA D-loop 區(qū)的多態(tài)位點及定義的單倍型Fig.1 Polymorphic sites and defined haplotypes in mtDNA D-loop sequences of Tengchong White Chicken

將本研究騰沖雪雞的序列與已發(fā)表的11 個云南其他地方雞的647 條mtDNA D-loop 區(qū)序列進行聯(lián)合分析，獲得云南各地方雞群體遺傳多樣性結(jié)果(表1)。在整個云南地方雞數(shù)據(jù)集中共發(fā)現(xiàn)62 個變異位點，其中單一信息位點8 個，簡約信息位點54 個，共確定87 個單倍型。騰沖雪雞與已檢測的云南其他地方雞相比，群體遺傳多樣性水平相對較高。

表1 云南12 個地方雞群體的遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity in 12 indigenous chickens in Yunnan

2.2 群體遺傳分化

將本研究數(shù)據(jù)與已發(fā)表的11 個云南地方雞數(shù)據(jù)合并，估算出云南地方雞平均遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.148 05，群體間基因流Nm=2.88。云南12 個地方雞群體間的Fst在0.000 0～0.587 4 之間；其中，蘭坪絨毛雞與其他云南地方雞群體間遺傳分化最大，而武定雞與西疇烏骨雞、華坪烏骨雞與他留烏骨雞和普洱毛腳烏雞、他留烏骨雞與普洱毛腳烏雞間遺傳分化最小。騰沖雪雞與其他11 個地方雞群體間的Fst在0.018 1～0.341 2 之間，其中，騰沖雪雞與他留烏骨雞遺傳分化最小，與蘭坪絨毛雞遺傳分化最大?；谠颇?2 個地方雞群體間的遺傳分化指數(shù)構(gòu)建的聚類樹見圖2。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與世系組成

用騰沖雪雞所有樣品的mtDNA D-Loop 區(qū)序列構(gòu)建NJ 無根系統(tǒng)樹。由圖3 所示：在系統(tǒng)樹上，所有騰沖雪雞樣品聚為支持率較高(＞85%)的5 個分化世系，分別與LIU 等[11]和MIAO 等[12]定義的家雞mtDNA 母系世系A(chǔ)、B、E、F 和G相對應(yīng)。騰沖雪雞中發(fā)現(xiàn)的21 個單倍型(H01～H21)都可以劃分到已知的母系世系中，其中H03～H05 屬于A 世系，H01 和H02 屬于B 世系，H06～H09 屬于E 世系，H10～H18 屬于F 世系，H19～H21 屬于G 世系。本研究及已發(fā)表數(shù)據(jù)的單倍型世系劃分及各世系在群體中所占的比例見表2。云南12 個地方雞群體的mtDNA 母系世系血統(tǒng)含有3～7 個不等，其中，西疇烏骨雞含有的母系世系最少，而大圍山微型雞的最多。與已檢測的云南其他地方雞相比，騰沖雪雞群體世系組成與其他雞種明顯不同。

3 討論

本研究在144 只騰沖雪雞中發(fā)現(xiàn)了33 個突變位點，單倍型多樣度為0.890±0.011；核苷酸多樣度為0.016 41±0.000 28；群體內(nèi)遺傳距離及整個群體平均多樣性均為0.017±0.004。一般核苷酸多樣度不受樣本含量的影響，是衡量群體遺傳多樣性的主要指標(biāo)[10]。在云南12 個地方雞群體中，蘭坪絨毛雞遺傳多樣性最低，其次為拉伯高腳雞；除了他留烏骨雞外，騰沖雪雞的核苷酸多樣度和群體內(nèi)遺傳距離均高于其他雞種。與近年已檢測的中國一些其他地方雞種相比[20]，騰沖雪雞的核苷酸多樣度也較高。由此，揭示騰沖雪雞群體內(nèi)遺傳變異豐富，存在多向選育潛力，這與該雞種未經(jīng)系統(tǒng)的現(xiàn)代育種技術(shù)選育，是原始地方雞種的實際情況相一致。該雞是長期在當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境條件和當(dāng)?shù)厝罕姳硇瓦x擇的作用下逐漸形成的。因此，該雞對當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境及粗放的養(yǎng)殖條件具有較強的適應(yīng)性。

圖2 基于云南12 個地方雞群體間的遺傳分化指數(shù)構(gòu)建的聚類樹Fig.2 Clustering tree constructed by genetic differentiation index between 12 indigenous chickens in Yunnan

表2 云南12 個地方雞群體的世系血統(tǒng)構(gòu)成比Tab.2 Clade composition ratio in 12 Yunnan local chickens

群體遺傳分化分析顯示：云南地方雞群體間存在不同程度的遺傳分化，其中，蘭坪絨毛雞與云南其他地方雞群體間遺傳分化最大。相比而言，騰沖雪雞與云南其他地方雞存在的遺傳分化也較大；其中，該雞與他留烏骨雞遺傳分化最小，與蘭坪絨毛雞遺傳分化最大。在基于云南地方雞群體間的遺傳分化指數(shù)構(gòu)建的聚類樹上，顯示騰沖雪雞與云南其他地方雞遺傳差異較大。這與騰沖雪雞在形成過程中長期閉鎖繁育，與云南其他地方雞基因交流有限有關(guān)。

圖3 基于騰沖雪雞D-loop 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed by using mtDNA D-loop sequences of Tengchong White Chicken

近年研究顯示：家雞是多個母系起源的，世界家雞和紅原雞的mtDNA 母系世系可劃分為A、B、C、D、E、F、G、H 和I 等世系，其中，A 和B 世系在中國、日本和東南亞等地的地方雞中普遍存在，C 世系為中國黃淮流域地區(qū)地方雞所特有，F(xiàn)、G 和H 世系為云南及鄰近地區(qū)地方雞所特有，而E 世系在印度和歐洲家雞中出現(xiàn)頻率較高[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)：以往定義的mtDNA母系世系[11-12]在不同的云南地方雞中其構(gòu)成比不一樣，揭示這些地方雞種間存在遺傳組成上的差異。值得注意的是，云南及鄰近地區(qū)特有的F 和G 世系很可能為云南本地起源[11-12]，在本研究的大部分云南地方雞中有較廣泛的分布。騰沖雪雞樣品在系統(tǒng)樹上聚為分歧較大的5 個世系，分別與以往研究[11-12]劃分的A、B、E、F 和G 世系相對應(yīng)，表明騰沖雪雞含有5 個母系血統(tǒng)來源，提示騰沖雪雞可能是在本地起源的家雞基礎(chǔ)上，經(jīng)外來血統(tǒng)混入逐漸形成的，也為家雞多個母系起源的觀點提供了證據(jù)支持[11-13]。與云南其他地方雞相比，騰沖雪雞在母系血統(tǒng)構(gòu)成上與云南其他地方雞明顯不同，表明具有獨特的種質(zhì)遺傳特征。在騰沖雪雞群體中F、A 和B 世系所占的比例較高，為其主要世系。該雞群體中云南特有世系F 和G 占38.89%。已有研究結(jié)果表明：E 世系為南亞和歐洲家雞的母系血統(tǒng)來源，是外來商品雞中普遍存在的血統(tǒng)[11-12]，本研究在騰沖雪雞群體中發(fā)現(xiàn)存在15.28%的E 世系血統(tǒng)，推測該雞存在歐美來源的雞種基因滲入。這種基因滲入很可能是由于近年片面追求經(jīng)濟效益，大力推廣外來“快大型”肉雞或高產(chǎn)蛋雞，導(dǎo)致本地遺傳資源受到侵蝕的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究對騰沖雪雞mtDNA D-loop 區(qū)序列變異進行檢測，并結(jié)合已發(fā)表的云南其他地方雞數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果揭示騰沖雪雞群體遺傳多樣性豐富，存在選育潛力。該雞母系血統(tǒng)構(gòu)成特征獨特，在遺傳組成上含有A、B、E、F 和G 5 個母系血統(tǒng)來源，云南特有的血統(tǒng)F 和G 世系占38.89%；該雞可能存在一定比例外來商品雞的基因滲入。在該雞的保種工作中，建議對其保種群進行遺傳鑒定，淘汰外血混入種雞，并在保種區(qū)禁止外來雞種的引進。