曹巧，史占良，張國叢，班進(jìn)福，鄭樹松，傅曉藝，張士昌，何明琦，韓然，高振賢*

1.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，石家莊050041；

2.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京100101

靶向突變或?qū)蚪M進(jìn)行精確的改變是生物學(xué)研究的重點，過去10年，鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）[1]、TAL效應(yīng)子核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs）[2]和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9）[3]對應(yīng)的3種基因組編輯技術(shù)得到迅速發(fā)展，這些系統(tǒng)以類似方式在基因組中產(chǎn)生位點特異性雙鏈斷裂（double strand breaks，DSBs），誘導(dǎo)生物體通過非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組（homology-directed repair，HDR）的方式修復(fù)DSBs。在修復(fù)過程中NHEJ在酶切位點發(fā)生堿基插入或缺失（insertions/deletions，Indels），當(dāng)人為提供同源供體DNA時，HDR可實現(xiàn)對基因組DNA的定點替換[4]。ZFNs和TALENs具有識別DNA特異序列和切割DNA靶序列的限制性內(nèi)切酶兩種功能結(jié)構(gòu)域，已成功應(yīng)用于多種植物[1-2]。相比之下，CRISPR/Cas9系統(tǒng)由一個短引導(dǎo)核糖核酸（small guide RNA，sgRNA）和條件性脫氧核糖核酸酶Cas9組成[3]，sgRNA 5′端的20個核苷酸引導(dǎo)Cas9/sgRNA復(fù)合體沿著染色體脫氧核糖核酸尋找目標(biāo)，直至完全匹配。如果染色體上存在一個NGG三核苷酸-原間隔基序（protospacer adjacent motif，PAM）位于靶位點的下游，則會引起Cas9構(gòu)象變化，激活Cas9兩個獨立的核酸酶結(jié)構(gòu)域并導(dǎo)致靶位點的切割[5]，目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛運用于植物研究中。

小麥基因組編輯技術(shù)和遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展使小麥進(jìn)入了基因改造時代，然而由于小麥基因組的復(fù)雜性和遺傳轉(zhuǎn)化效率低，小麥基因組編輯的進(jìn)展仍落后于其他農(nóng)作物。目前，小麥基因組編輯的研究主要集中于破壞基因，關(guān)于基因打靶和堿基編輯的報道仍較少。TALENs和CRISPR/Cas9技術(shù)已成功應(yīng)用于小麥基因編輯中，尤其是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，因系統(tǒng)的簡便、高效等特點應(yīng)用最廣泛，占比高達(dá)92.86%[6]。本文主要綜述了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在近代小麥新品種培育中的成功實踐，對前人的育種工作進(jìn)行歸納，以期為未來育種工作提供參考，促進(jìn)優(yōu)良小麥品種的持續(xù)更新和產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)

早在1987年就有研究者在細(xì)菌DNA中鑒定出CRISPRs[7]，但直至2007年CRISPRs才 被證明與Cas蛋白聯(lián)合提供免疫力[8]。2011—2012年人類最初在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過CRISPR-RNAs（crRNAs）介導(dǎo)入侵核酸的沉默，從而為細(xì)菌和古細(xì)菌提供了針對病毒和質(zhì)粒的適應(yīng)性免疫[9-10]。之后，5個獨立的研究小組將該基因編輯系統(tǒng)運用于動物中[11?15]。2013年有研究者首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在模式植物擬南芥、煙草和水稻開展基因編輯研究[16-17]。截至目前共發(fā)現(xiàn)有3種類型CRISPR/Cas系統(tǒng)（typeⅠ、typeⅡ和typeⅢ）[18-19]，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)存在共同點：特異的Cas核酸內(nèi)切酶處理pre-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）一旦成熟，每個crRNA組合成一個大型多Cas蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物識別并切割與crRNA互補的核酸序列；相比之下，Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)通過一種不同的機制處理pre-crRNA，利用tracrRNA（atrans-activating crRNA）與pre-crRNAs中的重復(fù)序列互補，同時在Cas9存在時觸發(fā)雙鏈RNA特異核糖核酸酶RNaseⅢ活性[20]，Cas9被認(rèn)為是唯一負(fù)責(zé)crRNA引導(dǎo)的外源DNA沉默的蛋白質(zhì)[21]。目前經(jīng)過改造的Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)已成為一個高效、簡便的基因編輯工具，并在微生物、植物和動物基因功能研究和遺傳改良中得到廣泛應(yīng)用[22]。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的原理

成熟的crRNA與反式激活crRNA（transactivated crRNA，tracrRNA）堿基配對形成一個雙RNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)引導(dǎo)CRISPR相關(guān)蛋白Cas9觸發(fā)靶DNA雙鏈斷裂[3]。Cas9是一種DNA特異性的核酸內(nèi)切酶，Cas9蛋白在整個細(xì)菌界均較豐富，但序列和大小差異較大，所有已知的Cas9酶均含有一個HNH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域切割與sgRNA序列互補的DNA鏈（靶鏈），以及一個RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域切割非互補鏈（非靶鏈），產(chǎn)生雙 鏈DNA斷 裂（double strand break，DSB）[23]。Jinek等[5]研究了2種主要Cas9酶亞型2.6和2.2埃分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了所有Cas9家族成員共有的核心結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中含一個結(jié)合核酸的裂縫，單粒子電子顯微鏡重建顯示，形成裂縫的兩瓣類似鉗狀，當(dāng)sgRNA與Cas9結(jié)合后誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)重塑，形成一個中心通道，與DNA底物結(jié)合。Cas9廣泛的結(jié)構(gòu)重塑發(fā)生于與靶DNA雙鏈結(jié)合之前，暗示sgRNA的裝載是Cas9激活的關(guān)鍵步驟。使用CRISPR/Cas進(jìn)行基因組編輯時，含部分雙鏈tracrRNA:crRNAs被設(shè)計成sgRNAs，sgRNAs保留了2個關(guān)鍵特征，5′端與靶DNA互補，3′端與Cas9蛋 白結(jié) 合[24]。CRISPR/Cas結(jié) 合和 切 割DNA均需要識別一個短的三核苷酸原間隔基序（protospacer adjacent motif，PAM），DNA異源雙鏈形成始于PAM，并向靶序列的遠(yuǎn)端方向進(jìn)行，與PAM的相互作用觸發(fā)Cas9的催化活性[25]，導(dǎo)致DSBs，進(jìn)而誘導(dǎo)生物體通過非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組（homology-directed repair，HDR）修復(fù)DSBs，完成基因編輯過程。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的優(yōu)缺點

使用傳統(tǒng)育種方法在多倍體農(nóng)作物，如甘蔗、棉花、小麥和馬鈴薯中引入理想性狀是一項具有挑戰(zhàn)性且耗時的工作，此外多倍體植物中用傳統(tǒng)育種方法進(jìn)行多性狀的滲入和代謝改變也較困難。CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)與傳統(tǒng)的育種方法相比優(yōu)勢明顯，可同時靶向多個基因或代謝途徑，而不產(chǎn)生任何連鎖冗余。如CRISPR/Cas9可有效用于編輯多個目的基因，已被開發(fā)用于在小麥中產(chǎn)生對白粉病的廣譜抗性[26]；且還用于棉花[27]、鄧肯葡萄柚[28]和馬鈴薯[29]多倍體農(nóng)作物中產(chǎn)生突變。

Cas9蛋白的脫靶活性是CRISPR/Cas基因組編輯的主要問題，因Cas蛋白可以編輯任何與其sgRNA約5個錯配的DNA序列[30]，但在大多數(shù)情況下，Cas9/sgRNA不能識別與sgRNA錯配大于3的DNA序列[24]。盡管在植物中觀察到的脫靶活性處于表面水平，但仍需要開發(fā)直接的方法以克服脫靶效應(yīng)，確保Cas9編輯的特異性。CRISPR/Cas9試劑的一些特性已被證實與Cas9的脫靶傾向有關(guān)。有報道表明Cas9/sgRNA不能識別和編輯PAM位點10～12 bp范圍內(nèi)不匹配的DNA位點，Cas9蛋白質(zhì)對NGG-PAM的親和力高于NAG-PAM[31]。根據(jù)以上結(jié)果設(shè)計了幾種策略以降低高離標(biāo)率：①選擇GC含量較高（大于70%）的目標(biāo)位點[32]；②截短sgRNAs，使目標(biāo)互補區(qū)長度小于20個核苷酸，在不降低目標(biāo)基因組編輯效率的情況下，降低偏離目標(biāo)部位的意外突變（≥5 000倍）[33]；③Cas9催化亞基的突變（RuvC中的D10A和HNH中的H840A）使Cas9轉(zhuǎn)化為DNA切刻酶，2個Cas9切刻酶與一對與靶基因座互補的sgRNAs可以介導(dǎo)DSB，有效降低脫靶[34]。隨著測序發(fā)展和生物信息學(xué)軟件工具的開發(fā)，以及對Cas9的不斷改良，可以明顯提高編輯效率，降低脫靶造成的不利影響[24]。

4 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在小麥中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9是目前小麥中應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)，其較ZFNs和TALENs具備以下5個明顯優(yōu)點：①CRISPR/Cas9系統(tǒng)只有Cas9蛋白和sgRNA兩個簡單組分，而ZFNs和TALENs均為嵌合核酸酶，含有FokI切割和DNA結(jié)合兩個結(jié)構(gòu)域，且以二聚體的形式發(fā)揮作用；②CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過sgRNA借助堿基配對將Cas9招募到靶向DNA序列，而ZFNs和TALENs需要借助蛋白和DNA的相互作用；③Cas9的目標(biāo)大小僅為20 bp，而ZFNs和TALEN為40 bp；④同時對多個基因進(jìn)行基因編輯時CRISPR/Cas9系統(tǒng)較ZFNs或TALENs更高效、省時[14]；⑤用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒較ZFNs和TALENs系統(tǒng)易于組裝。鑒于以上原因使CRISPR/Cas9成為全世界最流行的基因組編輯技術(shù)。

4.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)

目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是將CRISPR/Cas9 DNA組分輸送到植物中最重要和最常見的方法[35]。2018年前小麥獲得基因編輯后代植株的基因組編輯系統(tǒng)多是通過粒子轟擊法實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的[36-37]，但其在將載體骨架上的大片段DNA共轉(zhuǎn)移時易導(dǎo)致高頻的轉(zhuǎn)基因沉默事件發(fā)生[38]。相比之下，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化因待轉(zhuǎn)移的DNA片段被限定在雙元載體中的左右邊界，通常在轉(zhuǎn)移DNA（transfer DNA，T-DNA）時只產(chǎn)生簡單的插入，降低了轉(zhuǎn)基因沉默頻率[39]。隨著小麥中農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率的提高[40]和可用于轉(zhuǎn)化的受體小麥基因型范圍擴(kuò)大[41]，使其在小麥基因組編輯中成為一種更有前景的轉(zhuǎn)運遺傳物質(zhì)的手段。Zhang等[42]成功地構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在4個籽粒調(diào)控相關(guān)基因中分別產(chǎn)生靶向突變，轉(zhuǎn)基因保持活性并持續(xù)誘導(dǎo)T1代和T2代的位點特異性突變。

4.2 影響CRISPR/Cas9基因編輯的因素

CRISPR/Cas9系統(tǒng)無論采用粒子轟擊法還是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行基因編輯時，均需要先將構(gòu)建好的載體進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，并對其轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行評價，進(jìn)而選出構(gòu)建的最佳載體進(jìn)行后續(xù)愈傷組織的轉(zhuǎn)化試驗。Zhang等[42]通過將構(gòu)建的pOsUbi-GFP、pUC-35S:GFP+1載體轉(zhuǎn)染小麥原生質(zhì)體后進(jìn)行熒光比較，發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）中1 bp的插入導(dǎo)致GFP無法表達(dá)，當(dāng)pTaU6.1-gGFP、pTaU6.2-gGFP、pTaU6.3-gGFP、pTaU6.5-gGFP分別與ZmUbi-Cas9-GFP共同轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體時會對GFP進(jìn)行基因編輯，導(dǎo)致熒光發(fā)生變化，熒光經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化校正后發(fā)現(xiàn)U6啟動子引導(dǎo)的sgRNA編輯效率為47.4%～68.5%。表明構(gòu)建含有不同啟動子的sgRNA載體轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體時，對基因的編輯效率存在明顯差異，因此小麥中構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時，選用sgRNA的高效率啟動子有利于提高基因編輯效率。Wang等[43]在TaGW7基因的前3個外顯子內(nèi)共選擇了8個靶位點，利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)對其進(jìn)行基因編輯，3個同源基因（TaGW7?A1、TaGW7?B1和TaGW7?D1）中有7個目標(biāo)位點是保守的，GW7T4靶基因僅在TaGW7?B1和TaGW7?D1之間是保守的，通過構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體和下一代測序?qū)γ總€gRNA靶點的效率進(jìn)行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因編輯效率為0.10%～10.94%，其中GW7T6效率最高，而GW7T4效率最低。表明靶點位置的選擇顯著影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小麥中的基因編輯效率，在六倍體小麥中同時實現(xiàn)對3個等位基因的編輯時應(yīng)優(yōu)先選取保守序列作為靶位點。

4.3 CRISPR/Cas9基因編輯效果

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)通過產(chǎn)生DSBs，進(jìn)而誘導(dǎo)生物體修復(fù)DSBs，此時導(dǎo)致的突變多為缺失和插入突變。如部分遺傳易感個體在攝入小麥醇溶蛋白時引發(fā)乳糜瀉，其是一種自身免疫性疾病，Sánchez-León等[36]利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得α-醇溶蛋白突變體，這些突變體中堿基變化范圍在?126～+158 bp，在一個已經(jīng)鑒定出45個不同野生型α-醇溶蛋白基因的小麥品系中，使多達(dá)35個基因發(fā)生了突變，從而使該突變體小麥的免疫反應(yīng)性降低了85%。GW2基因是谷類作物粒重的一個關(guān)鍵遺傳決定因素，在六倍體普通小麥中有3個 同 源 基 因（TaGW2?A1、TaGW2?B1和TaGW2?D1），Zhang等[44]利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得缺失1個（B1或D1）、2個（B1和D1）或3個（A1、B1和D1）TaGW2同源基因的基因編輯突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自不同基因組的TaGW2的單拷貝突變的小麥植株，其粒徑和千粒重（thousand-grain weight，TGW）均呈上升趨勢；雙同源突變體表現(xiàn)出比單基因組突變體更高的表型變異；在三重突變體中粒徑和TGW的增加幅度最大。Singh等[45]利用CRISPR-Cas9技術(shù)在Ta?Ms45基因的A、B和D同源序列中產(chǎn)生突變，最終導(dǎo)致花粉發(fā)育中止，實現(xiàn)雄性不育。Abe等[46]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)研究了小麥中控制種子休眠的Qsd1同源等位基因，獲得了多重突變，延長了種子的休眠期，并降低了小麥穗發(fā)芽率。以上均是CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在小麥中進(jìn)行實踐的成功案例，隨著該技術(shù)的不斷成熟，未來會有越來越多的對人類有益的小麥基因編輯突變體產(chǎn)生，也更有利于對小麥基因功能進(jìn)行解析。

4.4 CRISPR/Cas9基因編輯的發(fā)展

新開發(fā)的高效胞嘧啶脫氨酶介導(dǎo)了胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，在疾病治療和農(nóng)藝性狀改良方面具有巨大應(yīng)用潛力[47]，擴(kuò)大編輯更多的DNA核苷酸需額外的堿基編輯工具，如嘌呤堿基的替換或嘌呤和嘧啶之間的顛換。Zong等[48]將改良的tRNA腺苷脫氨酶與核酸酶滅活的CRISPR/Cas9融合，首次在小麥中實現(xiàn)將靶點目標(biāo)腺嘌呤轉(zhuǎn)化成鳥嘌呤。高效的堿基編輯效率，低插入缺失突變和高純度產(chǎn)品使該植物的腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）表現(xiàn)優(yōu)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)中HDR介導(dǎo)的基因組編輯。Zong等[48]通過優(yōu)化tRNA腺苷脫氨酶相對于nCas9的位置、核定位信號（nuclear localization signal，NLS）的數(shù)量和位置以及不同形式的sgRNA，發(fā)現(xiàn)腺苷脫氨酶ecTadA-ecTadA*置于nCas9氨基末端，3個NLSs置于nCas9碳端，并搭配esgRNA使得ABE在小麥中的編輯效率最高。該ABE系統(tǒng)仍有進(jìn)一步優(yōu)化和擴(kuò)展的可能，如可以使用生物技術(shù)改造Cas9識別不同的PAM，擴(kuò)展目標(biāo)的位點數(shù)量[49]。

Lin等[50]基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)的Prime editor在小麥中實現(xiàn)點突變、插入和缺失，較堿基編輯系統(tǒng)可以創(chuàng)制更多的突變類型。Prime editors是CRISPR-Cas9切口酶和逆轉(zhuǎn)錄酶相融合，經(jīng)過改造的向?qū)NA（prime editing guide RNAs，pegRNA）與Prime editors蛋白結(jié)合，基因編輯過程中不涉及供體DNA或雙鏈斷裂。Lin等[50]通過對密碼子、啟動子和編輯條件的優(yōu)化，開發(fā)了用于小麥的Prime editor，小麥原生質(zhì)體基因編輯的效率約為1.4%。目前該方法在小麥中轉(zhuǎn)化效率較低，僅限于原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)研究，尚未獲得基因編輯的小麥植株。

5 展望

雖然基因編輯技術(shù)在小麥上已經(jīng)有了發(fā)展路線，但仍有許多方面需要改進(jìn)以提高小麥的生產(chǎn)力。①基因編輯過程中涉及的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化對小麥基因型具有依賴性。雖然已有15個中國商品小麥品種被農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化，但大多數(shù)基因型的轉(zhuǎn)化效率較低，如濟(jì)麥22、矮抗58、輪選987和京411[51]，因此，在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中，需克服基因型依賴性；②雖然CRISPR/Cas9相關(guān)技術(shù)因其高效、特異、簡單和多功能而被廣泛用于小麥基因組編輯，但通常Cas9識別的PAM為NGG，限制了其目標(biāo)范圍，尤其對于堿基編輯器，單個堿基的變化有時不能使氨基酸改變。水稻中已經(jīng)開發(fā)出SpCas-NG，可以識別的PAM為NG、NTG、NTT和NCG，可明顯提高基因編輯效率。但小麥中尚未見相關(guān)報道，因此，擴(kuò)大PAM兼容性對小麥基因組編輯具有重要意義；③獲得無轉(zhuǎn)基因的基因編輯小麥植株。無轉(zhuǎn)基因的基因編輯小麥植株與傳統(tǒng)射線誘變獲得的突變體相似，無任何載體序列，但目前小麥中多借助載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，需要在后代中對是否含有載體片段進(jìn)行檢測。有研究者將預(yù)組裝的TALENs蛋白、CRISPR/Cas9核糖核蛋白或其mRNA遞送到植物細(xì)胞中，獲得了不含轉(zhuǎn)基因的基因編輯植物[52-53]，但由于組織培養(yǎng)過程中不存在選擇壓力，直接將TALENs或Cas9蛋白輸送至小麥細(xì)胞中低效且費力。采用RNA病毒做為載體完成DNA轉(zhuǎn)運可以獲得無轉(zhuǎn)基因的基因編輯小麥，Choi等[54]已成功利用被修飾的小麥條紋花葉病毒攜帶異源編碼序列，實現(xiàn)蛋白質(zhì)在小麥中的表達(dá)。將來需要科研工作者研發(fā)出將CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)至到小麥中的高效病毒載體，獲得無轉(zhuǎn)基因的基因編輯小麥植株，以廣泛應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。