姚婷婷，劉夢昱，趙鵬翔，王惠，儀楊，謝飛，YAO Mawulikplimi Adzavon

北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部，北京100124

膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)的原發(fā)性腫瘤，起源于大腦的固有組成細胞[1]，占顱內腫瘤的40%～50%。惡性膠質瘤約占中樞神經系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤的80%[2]。美國腦腫瘤注冊中心（Central Brain Tumor Registry of the United States，CBTRUS）的統(tǒng)計數據表明，膠質瘤年發(fā)病率約為6.4/10萬[3]，發(fā)病高峰期在70歲后，且5年生存率隨著年齡的增長呈正態(tài)分布趨勢[4]。膠質瘤按世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分級標準分為4級，其中Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤，患者平均存活時間為3～5年；Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤，患者平均存活時間為1～2年[5]。膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是惡性膠質瘤的最高級形式[3?4]。由于其異質性和滲透性，GBM對大多數治療方式的反應是不可預測的，該病的復雜性成為了發(fā)展有效治療方法的主要障礙。

目前膠質瘤主要采用手術切除為主，放化療為輔的常規(guī)綜合性標準治療，但常規(guī)治療患者預后較差。由于膠質瘤浸潤性生長模式，手術切除只能在肉眼可見的范圍內進行切除，但腦部精微結構要求在不擴大切除范圍的基礎上盡可能的將膠質瘤切除干凈；且放療易引發(fā)相關不良反應，如惡心、嘔吐、脫發(fā)等，嚴重影響患者的身體健康。此外，替莫唑胺（temozolomide，TMZ）為治療膠質瘤的常用化療藥物，但其治療效果受到獲得性耐藥的限制，且其中涉及的治療機制尚不明確。基于此，本研究通過分析膠質瘤的耐藥機制，旨在為更好地選擇化療藥物和改善GBM的耐藥性提供理論依據。

1 常用化療藥物的作用機制

近年來，在臨床上以及科學研究中，治療膠質瘤的藥物較多，其中最常見的烷基化劑包括達卡巴嗪（dacarbazine，DTIC）、卡莫司?。╟armustine，BCNU）、洛莫司?。╟omustine,CCNU）和TMZ，這些藥物或其活性形式會產生親電甲基重氮離子，在細胞內DNA中發(fā)揮親核試劑的作用，并導致多種加合物的形成，而加合物的分布、半衰期、性質和細胞特性決定了細胞毒性的程度和產生耐藥的可能性[6]。

TMZ于1995年被美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）批準進入臨床使用，是最早被批準用于臨床治療膠質瘤的烷基化藥物，其在正常的胃酸水平下不會被水解，可穩(wěn)定存在。但TMZ在生理pH下會發(fā)生水解，導致5-（3-甲基三唑-1-基）咪唑-4-羧酰胺[5-（3-methyltriazol-1-yl）imidazole-4-carboxamide，MTIC]的形成。MTIC進一步水解為5-氨基咪唑-4-羧 酰 胺（5-aminoimidazole-4-carboxamide，AIC）和甲基重唑，進而與DNA反應并釋放甲基基團，使DNA堿基上帶有1個甲基基團。其中鳥嘌呤N7位置（N7MeG）和腺嘌呤N3位置（N3MeA）是最常見的甲基加合物，分別占總烷基加合物的70%和10%[7]。鳥嘌呤O6位置（O6MeG）雖然只占總DNA甲基加合物的5%，但其具有前誘變和前毒性，因此造成的DNA損害是最嚴重的。

2 DNA修復損傷機制

TMZ對膠質母細胞瘤細胞的DNA造成損傷后，可激活多種耐藥機制，其中DNA修復機制因被化療激活發(fā)揮關鍵作用。DNA修復途徑包括直接修復、錯配修復（mismatch repair，MMR）及堿基切除修復（base excision repair，BER）。

2.1 直接修復

TMZ治療膠質瘤的主要機制之一是通過誘發(fā)鳥嘌呤O6位的甲基化從而導致膠質瘤患者死亡。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（O6-methyl guanine DNA methyltransferase，MGMT）是 一 種DNA修復酶，可通過去除鳥嘌呤O6位的甲基直接修復由TMZ引起的病變，其通常在癌癥中過表達，并與膠質瘤化療耐藥性的發(fā)展相關。此外，MGMT是一種相對分子質量為22 kD的蛋白質，其在烷基轉移反應中可將O6位置上的烷基化加合物轉移到自身催化袋中半胱氨酸的殘基上，從而使DNA得以恢復并使發(fā)揮作用的帶有烷基加合物的MGMT失活。而滅活的MGMT可能被泛素化[8?9]，然后通過蛋白酶體機制被降解[10]。由于一個MGMT分子只能修復一個烷基加合物，使得每個細胞中MGMT分子的總數和細胞重新合成MGMT的速率成為細胞去除DNA O6-烷基鳥嘌呤加合物的限速步驟。因此，化療藥物損傷后的DNA修復依賴于MGMT的連續(xù)表達。大多數MGMT定位于細胞質中，在DNA烷基化損傷后通過烷基化轉移[11]至細胞核中，但目前其具體機制尚不清楚。

已有研究者對正常組織和腫瘤中的MGMT活性進行了研究，MGMT有明顯的組織特異性，其在肝臟和結腸中表達較高，在大腦中表達較低[12]。已有研究發(fā)現，MGMT啟動子甲基化在GBM中是可行的，且與TMZ的良好臨床反應相關[13]。有研究顯示，在替莫唑胺治療后通過激活各種信號通路導致MGMT蛋白發(fā)生變化，如激活典型的Wnt/β-catenin信號級聯可誘導MGMT表達，而抑制Wnt信號可增強烷基化藥物的作用，并恢復不同癌癥的化學敏感性[14]。在大鼠肝癌細胞中MGMT的轉錄激活發(fā)生在射線或烷基化劑處理后12～24 h[15]。HeLa S3細胞中，在使用不同的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活劑處理后MGMT表達水平增加了3～5倍[16]。MGMT啟動子有2個AP-1結合位點，其缺失會減弱TPA對MGMT啟動子的激活[16]。除AP-1的調控外，p53也被證明在電離輻射誘導MGMT基因時是必需的。如MGMT水平決定了腫瘤易感性，則開發(fā)預測性的MGMT分析將是有利的。由于降低MGMT在腫瘤中的活性是可能實現的，基于MGMT的治療甚至有望擴展到許多其他類型的實體和造血腫瘤。但抑制MGMT的藥物如鳥嘌呤的合成衍生物O6-芐基鳥嘌呤（O6-benzylguanine，O6BG），可抑制MGMT由于其血液毒性和效率低下而受到的阻礙[17]，因此，考慮聯合治療的方案。Bcl-2水平的下降是p53突變細胞中O6MeG觸發(fā)凋亡的標志[18]，并且已有實驗驗證MGMT抑制劑與Bcl-2抑制劑同時使用是一種可行的策略[19]。在神經膠質瘤中，O6MeG通過激活在p53突變的腫瘤中的線粒體和p53控制的Fas依賴通路觸發(fā)凋亡[18]。由于MGMT可明顯抑制細胞凋亡，增加p53對膠質瘤的反應，因此，MGMT和p53被認為是該腫瘤實體中O6AA耐藥的預測因子[20]。

2.2 堿基切除修復

N7MeG和N3MeA的甲基化水平占TMZ甲基化總水平的80%以上[7]，而BER能快速地進行修復，從而促進GBM的生存，在TMZ耐藥機制中發(fā)揮重要的作用。BER系統(tǒng)是由DNA糖基化酶、核酸內切酶、聚合酶和DNA連接酶的多催化反應組成。當BER的1個或多個組分發(fā)生突變時，會導致BER修復DNA損傷的能力不足，進而導致TMZ對GBM的細胞毒性。值得注意的是，與N7病變不同，N3病變如不修復將是致命的。BER是由DNA糖基化酶識別和切除修飾的堿基開始的[21]，隨后進行修復合成以恢復序列。負責修復和去除N3MeA、N7MeG和N3MeG的糖基化酶是N-甲基嘌呤-DNA糖基化酶（N-methylpurine-DNA glycosylase，MPG）[22]；且有研究表明，敲除MPG基因的小鼠可存活[23]。在BER的組成成分中，聚ADP核糖聚合酶-1[poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1]被認為是一種具有雙重作用的重要酶。PARP-1的抑制導致細胞中斷裂DNA的積累，進而導致細胞死亡。由DNA損傷產生的PARP-1過度激活導致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和 三 磷 酸 腺 苷（adenosine triphosphate，ATP）的消耗，進而導致細胞死亡。研究表明，酪氨酸激酶抑制劑多韋替尼可下調患者GBM細胞中的HMGA 2、BER等成員，從而提高TMZ的敏感性[24]。TMZ與PARP1抑制劑維利帕尼聯合治療即使在高度TMZ耐藥的GBM細胞中也可發(fā)揮協同治療作用[25]。另一種參與BER的重要蛋白是PARP-1。作為對烷基化劑誘導的DNA損傷反應，PARP-1與DNA單鏈斷裂結合，形成自聚ADP-核糖化，這使其能與其他蛋白相互作用，如 聚 合 酶（Pol）[26]和XRCC1[27]。PARP-1與FEN-1協同通過Pol刺激鏈置換和DNA修復合成，從而促進長補丁BER[28]。此外，PARP-1還介導XRCC1招募到單鏈斷裂處[29]，并保護DNA修復中間體免受核酸酶攻擊[30]。

2.3 錯配修復（mismatch repair，MMR）

MMR路徑主要用于防止復制錯誤和不正確插入引起的錯配。MMR由MutS和MutL兩部分組成。MutS蛋白是一種錯配識別因子，而MutL介導MutS和修復復合體的其他成員如外切酶、解旋酶和聚合酶之間的交叉對話。MMR系統(tǒng)具有高度的保守性，真核生物中保留多種功能。但在高等生物中，功能更復雜，目前已經發(fā)現了6個MutS同源物和多種MutL同源物，由于其與酵母減數分裂后的分離有關，又被稱為MLH或PMS。

在哺乳動物中，MSH2和MSH6異質二聚體能夠識別堿基錯配[31]，而另一對由MLH1和PMS2組成的異源二聚體被招募到修復位點調節(jié)這一過程。未修復的O6MeG與胸腺嘧啶配對而不是胞嘧啶配對，使O6MeG-T被MMR識別，將胸腺嘧啶從新合成的鏈中移除，且不損傷O6MeG。在下一個復制周期中，再次發(fā)生不匹配，并重復修復周期。這種無效的MMR循環(huán)導致復制叉停止，細胞試圖分裂，導致雙鏈斷裂。這些雙鏈斷裂對細胞有細胞毒性，所以O6MeG誘導的細胞毒性需要細胞表達MMR活性[32]，而在無MMR的情況下，O6MeG錯配不被識別，導致化學耐藥性。目前鮮有報道證明在GBM的MMR成分突變，然而，在復發(fā)性GBM中，MSH6的這種突變導致其表達量下降，進一步證實了TMZ可以通過滅活MMR的活性，從而使膠質母細胞瘤產生耐藥性。最近有研究表明EGFRvIII+通過上調DNA MMR來增加GBM對TMZ的敏感性，并導致TMZ治療后DNA雙鏈斷裂數量增加和明顯的S/G2期阻滯[33]。

3 藥物外排轉運體與TMZ耐藥機制

在癌癥治療中，藥物外排轉運體的過度表達通常與多藥耐藥有關。癌癥化療失敗原因之一是藥物外排轉運體通過增加化療藥物外排，導致細胞內藥物水平降低，進而導致腫瘤對藥物不敏感，并且藥物外排轉運體機制通常對多種化療藥物均是有效的。多藥耐藥（mutiple drug resistance，MDR）的機制涉及到ATP結合盒（ATP-binding cassette,ABC）轉運蛋白超家族成員的高表達，其中最主要的藥物外排轉運體有3種，分別為ABCB1（又稱為MDR1或P-糖蛋白）、ABCC1（又稱為MRP1）、ABCG2，其中ABCB1研究最多。

研究已經證實了ABCB1在幾種癌癥中的臨床相關性，但其他轉運體的臨床相關性仍不確定。有研究表明ABCB1基因的破壞會導致許多組織中藥物水平升高[34]。MDR1位于細胞膜上，由結構相似的兩部分組成，每一部分均有一個由6個疏水跨膜螺旋組成的跨膜結構域（transmembrane domain，TMD）和一個高度保守的核苷酸結合域（nucleotide-binding domains，NBD），且MDR1通過其上2個NBD與ATP的結合使ATP水解釋放能量從而完成胞內物質轉運到胞外的功能。已有研究表明，MDR1上任何一個ATP結合位點如果被抑制，MDR1的外排功能也會受到影響。MDR1的高表達通常發(fā)生于腫瘤細胞受到抗腫瘤藥物的刺激后，腫瘤細胞為了自我保護，則會刺激MDR1 mRNA水平的高表達，從而使藥物外排量升高。ABCB1的表達水平與血管浸潤性密切相關[35]，同時，ABCB1在最大和最具侵襲性的軟組織肉瘤中表達最高[36]。此外，MDR1還可通過調節(jié)內源性與外源性凋亡途徑抑制腫瘤細胞的凋亡，降低抗腫瘤藥物的藥效。因此，通過抑制ABC轉運體克服耐藥性仍是研究的重點，而開發(fā)ABC轉運體抑制顯然是一種極其有吸引力的潛在化療輔助手段，但截至目前，ABC轉運體抑制劑開發(fā)至第三代在臨床試驗上效果仍不佳。

4 展望

清楚地了解TMZ耐藥機制對提高GBM患者術后預后方面有重要的意義，但臨床實踐表明，約50%的患者對TMZ表現出耐藥性。GBM對抗TMZ的機制提示，可以針對GBM的腫瘤特異性DNA修復漏洞，應用特異性耐藥靶點的抑制劑聯用的方法將有可能提高膠質母細胞瘤對TMZ的敏感性，如將MGMT的抑制劑與BER修復位點（如PARP-1）的抑制劑聯合應用于治療GBM患者理論上是完全可行的，但臨床實踐表明，當PARP-1的抑制劑與DNA損傷藥物共同使用時，會誘導骨髓抑制，限制了其推廣運用。因此，識別GBM相關的分子生物標志物具有重要意義，這也提示使用有活性但是安全的藥物聯合方案將是治療膠質母細胞瘤的有效途徑。

TMZ治療GBM的耐藥機制較復雜，除耐藥機制外，還存在其他機制，如GBM干細胞助力耐藥、自噬、mRNA與LncRNA相互作用降低化療藥物的治療效果等，此外，可能仍有一些機制目前尚未明確。隨著研究的深入，未來將會發(fā)現更多克服耐藥的方法與提高療效的途徑，提高GBM的治療效果，使更多的患者受益。