吳效科 ，于凱江 ，王永晨 ，徐萬海 ，馬紅麗 ，侯艷 ，李悅 ，蔡本志 ，朱麗影 ，張敏 ，胡曉麗 ，高敬書 ，王宇 ，秦慧超 ，王文杰 ，趙鳴雁 ，吳霞 ，張勇 ，李璐 ，李康 ，杜智敏 ，Bn Willm J. Mol ,楊寶峰 ,*

a College of Pharmacology, Harbin Medical University, Harbin 150001, China

b Heilongjiang Provincial Hospital, Harbin Institute of Technology, Harbin 150030, China

c First Affiliated Hospital, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

d First Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150001, China

e Second Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150001, China

f Fourth Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150001, China

g College of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

h Monash Medical Centre, Monash University, Melbourne, VIC 3800, Australia

1. 引言

2020年，由SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）打破了世界各地原本的社會生活狀態(tài)。新型冠狀病毒肺炎最常見的5個癥狀和體征是發(fā)熱、咳嗽、疲勞、肌痛和呼吸困難[1]。65歲以下的健康人群死亡率較低，而老年人與合并癥患者更容易出現(xiàn)嚴(yán)重后果，包括死亡[2,3]。

由于缺乏針對新型冠狀病毒肺炎的有效抗病毒療法，目前的治療主要集中于癥狀緩解和呼吸支持[4]。但是，關(guān)于COVID-19治療藥物的鑒定也做了大量工作，如已經(jīng)評估了氯喹、瑞德西韋、恢復(fù)期血漿和免疫球蛋白G的輸注等，盡管以上藥物的有效性尚未被證實(shí)[5,6]。

自2015年以來，新的抗病毒藥物特力阿扎維林（Triazavirin, TZV）進(jìn)入俄羅斯市場。TZV的主要作用原理是通過其合成類似物形成嘌呤核苷堿基，從而抑制病毒性核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）的合成和病毒基因組片段的復(fù)制[7–9]。TZV的II期臨床試驗(yàn)表明，該藥物可顯著縮短流感主要臨床癥狀（中毒、發(fā)熱和呼吸道癥狀）的持續(xù)時間，并減少流感相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率和對癥藥物的使用[10]。但是，TZV對新型冠狀病毒肺炎的療效尚不清楚。本研究針對此進(jìn)行了一項(xiàng)多中心安慰劑對照試驗(yàn)。

2. 方法

2.1. 研究設(shè)計(jì)

本研究在中國北方黑龍江省的10個分中心開展了多中心的隨機(jī)雙盲對照試驗(yàn)（randomized clinical trial,RCT）。研究方案獲得了當(dāng)?shù)胤种行牡臋C(jī)構(gòu)倫理審查委員會批準(zhǔn)，所有參與者均簽署了知情同意書。本研究由多學(xué)科構(gòu)成的指導(dǎo)委員會主持，由獨(dú)立的數(shù)據(jù)安全監(jiān)察委員會（Data and Safety Monitoring Board, DSMB）按照標(biāo)準(zhǔn)化的不良事件報告程序全程監(jiān)管。獨(dú)立的研究監(jiān)察員全程參加了研究流程，并核查了所有的數(shù)據(jù)。本研究已在中國臨床試驗(yàn)注冊中心注冊，注冊號為ChiCTR20000300001，研究方案已于近期發(fā)表[11]。

2.2. 倫理

本研究是在遵照《赫爾辛基宣言》的原則，遵循黑龍江省衛(wèi)生健康委員會的相關(guān)法律法規(guī)和行政規(guī)定的前提下進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。獲得倫理委員會的批準(zhǔn)后才開展本試驗(yàn)。受試者已被告知相關(guān)的風(fēng)險和利益，并且受試者可以隨時出于任何原因停止并退出試驗(yàn)。為了保護(hù)受試者的隱私，每位受試者都用唯一的隨機(jī)號進(jìn)行識別，并且除研究人員知情外，患者的姓名和個人信息均對外進(jìn)行嚴(yán)格的保密。

2.3. 納排標(biāo)準(zhǔn)

本研究從所在研究分中心的急診科、隔離病房和重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit, ICU）招募COVID-19住院患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①由實(shí)驗(yàn)室實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）確診的SARS-CoV-2感染；②通過胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）成像證實(shí)肺損傷，包括肺內(nèi)多發(fā)小斑片影和間質(zhì)改變，以肺外帶明顯，或雙肺多發(fā)毛玻璃影和浸潤影（輕度患者可能不存在這些改變）；③發(fā)熱（腋溫≥37.0 °C）或有呼吸道癥狀；④癥狀發(fā)作到隨機(jī)時間間隔≤12 d；⑤在過去3個月內(nèi)未參加過其他臨床研究；⑥年滿18歲；⑦在治療與隨訪期的28 d內(nèi)不參加其他抗病毒研究；⑧簽署知情同意書。基線數(shù)據(jù)包括實(shí)驗(yàn)室檢查、人體測量學(xué)指標(biāo)和臨床數(shù)據(jù)、肺CT和咽拭子檢查等均在當(dāng)?shù)胤种行倪M(jìn)行。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①由主要研究者判斷，不適合或不能安全參與研究的患者；②根據(jù)Child-Pugh評分，評定為C級的嚴(yán)重肝病患者；③嚴(yán)重腎功能損傷[腎小球?yàn)V過率≤ 30 mL·(min·1.73 m2)–1]或持續(xù)腎臟替代治療、血液透析或腹膜透析的患者；④嚴(yán)重貧血的患者（血紅蛋白<60 g·L–1）；⑤孕婦或哺乳期婦女；⑥有對TZV或其代謝成分過敏史的患者；⑦有可能在隨機(jī)分組的72 h內(nèi)轉(zhuǎn)移到另一家醫(yī)院的患者；⑧在篩查前30 d內(nèi)參加了其他COVID-19臨床試驗(yàn)的患者。

2.4. 隨機(jī)與盲法

受試者按照計(jì)算機(jī)生成的分配序列在各分中心進(jìn)行區(qū)組隨機(jī)，區(qū)組長度設(shè)為4，按照1∶1比例進(jìn)行隨機(jī)分組。負(fù)責(zé)收集評估主要結(jié)局指標(biāo)的研究者和受試者對研究分組情況均不知情。

2.5. 干預(yù)方法

每個分中心的受試者均接受標(biāo)準(zhǔn)治療，并每日口服試驗(yàn)藥物TZV或安慰劑。輕度患者每天口服250 mg TZV藥物或安慰劑3次（每天9:00、13:00和17:00），連續(xù)服用7 d；而重癥患者則每天口服250 mg TZV藥物或安慰劑4次（每天9:00、13:00、17:00和21:00），連續(xù)服用7 d。

如患者出現(xiàn)發(fā)熱或呼吸道癥狀等表現(xiàn)，并且在影像學(xué)上可以看到肺炎的跡象，則認(rèn)為該患者為輕型/普通型患者。重型的定義是呼吸頻率≥30次·min–1，靜息狀態(tài)下室內(nèi)空氣中指尖氧飽和度（pulse oxygen saturation, SpO2）≤93%，動脈血氧分壓（PaO2）/吸氧濃度≤300 mmHg（1 mmHg≈133.28 Pa），或在肺部影像學(xué)顯示24～48 h內(nèi)病灶明顯進(jìn)展>50%。危重型是指出現(xiàn)呼吸衰竭且需要機(jī)械通氣，出現(xiàn)休克，或合并其他器官功能衰竭需要在重癥監(jiān)護(hù)病房進(jìn)行監(jiān)護(hù)治療。研究藥物由具有資質(zhì)的醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行管理。隨機(jī)分組后立即給患者服用第一劑TZV。除研究藥物或安慰劑外，所有患者均按照《新型冠狀病毒肺炎診療方案》接受常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)治療[4,12]。

研究藥物TZV由麥德森生物醫(yī)藥公司（俄羅斯，新烏拉爾斯克）生產(chǎn)，安慰劑由天晴干細(xì)胞有限公司（中國，哈爾濱高新技術(shù)開發(fā)區(qū)）生產(chǎn)。研究所需藥物和安慰劑由一家中國制藥廠進(jìn)行了重新包裝并使用相同標(biāo)簽及外包裝。如果患者退出試驗(yàn)，則停止服藥并將藥物回收。

用藥療程為7 d，需每天記錄患者的臨床癥狀、生命體征、指尖氧飽和度及不良事件。在第3天和第7天對患者進(jìn)行心電圖檢查、血?dú)夥治龊推渌麑?shí)驗(yàn)室檢查，并在第7天進(jìn)行CT檢查。隨訪時間為28 d或直至觀察到臨床病情改善，并在隨訪期的第8、9、10、14、21、28天在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院進(jìn)行相應(yīng)的檢查。

2.6. 樣本量估算

由于目前關(guān)于COVID-19的TZV藥物信息有限，且臨床需求迫切，我們計(jì)劃每組各招募120名患者，預(yù)計(jì)因死亡或其他不可預(yù)期因素而導(dǎo)致的退出率低于20%。但在招募了52名受試者之后，因連續(xù)一周內(nèi)不再有每日新增病例，于是按照DSMB的建議終止了受試者招募工作。

2.7. 統(tǒng)計(jì)分析

分類變量用計(jì)數(shù)和百分比進(jìn)行描述，用中位數(shù)、四分位間距（interquartile range, IQR）、平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行連續(xù)變量的描述。使用卡方檢驗(yàn)或費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)比較了各分類數(shù)據(jù)的占比。若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，則使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較連續(xù)數(shù)據(jù)的均值。若數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，則使用曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。本研究未對缺失數(shù)據(jù)進(jìn)行填補(bǔ)。

應(yīng)用Cox風(fēng)險比模型確定兩組間的癥狀緩解是否存在差異。p值小于0.05被視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究沒有進(jìn)行多重比較校正。所有統(tǒng)計(jì)分析均通過SAS軟件（版本9.4）完成。

2.8. 結(jié)果

2.8.1. 主要結(jié)果

主要結(jié)局指標(biāo)是臨床改善時間，即從隨機(jī)到病情恢復(fù)的天數(shù)。通過體溫、呼吸頻率、血氧飽和度、咳嗽緩解和通過肺CT檢測肺部感染吸收情況這5點(diǎn)來評估臨床改善。病情恢復(fù)的定義為：腋溫<37.0 °C，室內(nèi)呼吸頻率<24次·min–1，指尖氧飽和度>94%。咳嗽緩解的定義為：根據(jù)醫(yī)生報告量表重度或中度咳嗽降至輕度或無。肺部感染吸收的定義為：通過肺CT的醫(yī)學(xué)數(shù)字成像與通信（DICOM）顯示肺部感染吸收面積超過2/3。主要結(jié)局指標(biāo)臨床改善是指這5種臨床癥狀均恢復(fù)到正常狀態(tài)且至少保持72 h。

2.8.2. 次要結(jié)果

次要結(jié)局包括臨床改善率、退熱時間、退熱率、肺部炎癥明顯吸收的平均時間和占比、病毒核酸轉(zhuǎn)陰率、28 d內(nèi)的病死率以及重型/危重型的轉(zhuǎn)化率。輕型、普通型、重型和危重型的診斷標(biāo)準(zhǔn)和分類嚴(yán)格按照《中國新型冠狀病毒肺炎診斷和治療指南》執(zhí)行[4,12]。

退熱時間為自隨機(jī)開始直到體溫低于37.0 °C且持續(xù)至少24 h或72 h的天數(shù)。若咽拭子病毒核酸檢測結(jié)果為陰性，則間隔48 h后重復(fù)檢測。重型/危重型的轉(zhuǎn)化率使用六分量表進(jìn)行評估?；颊呷粢殉鲈夯蛄勘碓u估得分比基線水平下降兩分則納入統(tǒng)計(jì)。

2.8.3. 探索性結(jié)果

探索性結(jié)果是指實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的變化，包括血常規(guī)、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein, CRP）、凝血功能、心肌酶以及肝腎功能。上述指標(biāo)從異常到正常的恢復(fù)率也納入統(tǒng)計(jì)。

3. 結(jié)果

本研究中，我們篩選了245名患者，其中111名患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)，68名患者簽署了知情同意書。最終，共有52例診斷為COVID-19且經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診的患者接受了隨機(jī)分組（圖1）。第一名患者于2020年2月14日入組，本試驗(yàn)于2020年3月6日結(jié)束。由于當(dāng)時中國的COVID-19疫情已得到控制，連續(xù)一周無新增病例，因此DSMB決定提前終止該試驗(yàn)。

在52名患者中，26名患者分至TZV組，26名患者分至安慰劑組。最常見的合并癥為高血壓（28.8%）、心血管疾病（15.4%）、糖尿?。?5.4%）、腦血管疾?。?.7%）和慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmoriary disease, COPD）（5.8%）。TZV組有7名患者（26.9%）、安慰劑組有4名患者（15.4%）在研究的第2～6天期間停止服藥。停止服藥的具體原因詳見圖1。所有受試者數(shù)據(jù)均納入意向性分析數(shù)據(jù)集。

基線特征詳見表1和附錄A中的表S1?；颊叩闹形荒挲g為58歲（IQR，48～65歲），其中50%為男性。癥狀出現(xiàn)至隨機(jī)的時間間隔中位數(shù)為7 d（IQR, 5～10 d）。最常見的4個癥狀是干咳（55.8%）、鼻塞（38.5%）、咽痛（32.7%）和發(fā)熱（28.8%）。在52名患者中，有44名（84.6%）患者的肺CT異常，30名（57.7%）患者的肺部呈現(xiàn)雙側(cè)斑片狀毛玻璃陰影，18名（34.6%）患者存在肺實(shí)變，2名（3.9%）患者存在胸腔積液。

圖1. 試驗(yàn)參試者流程圖。

3.1. 主要結(jié)果

TZV 組臨床改善時間為7 d，而安慰劑組臨床改善時間為12 d [風(fēng)險比（relative risk, RR）為2.0；95%置信區(qū)間（confidence interval, CI）為0.7～5.6；p= 0.2；表2]。

3.2. 次要結(jié)果

在意向性分析人群中，TZV組有10名患者、安慰劑組有6名患者觀察到臨床改善（38.5% vs. 23.1%, RR: 2.1;95% CI: 0.6～7.0;p= 0.2）[圖2（a）、表2]。體溫維持在<37 °C并持續(xù)24 h或72 h的患者中，TZV組的退熱率高于安慰劑組（100.0% vs. 80.0%,p= 0.5; 87.5% vs. 70%,p= 0.6），退熱中位時間分別為45.5 h vs. 52.0 h,p= 1.0（持續(xù)24 h）和4.5 d vs. 6.0 d，p= 0.7（持續(xù)72 h）。

TZV組肺部感染吸收的中位時間為10 d，安慰劑組為12 d [RR: 2.0; 95%CI: 0.7～5.5;p= 0.2; 表2、圖2（b）]。TZV組的10名患者和安慰劑組的6名患者經(jīng)治療后肺部感染有明顯的吸收（50.0% vs. 26.1%, RR: 2.8; 95% CI:0.8～10.2;p= 0.1）。TZV組及安慰劑組病毒核酸轉(zhuǎn)陰率分別是92.3%和80.8%,p= 0.4 [表2、圖2（c）]。安慰劑組一名受試者在研究過程中死亡（表2）。兩組從重型或危重型到輕型或普通型的轉(zhuǎn)化率沒有顯著差異（100.0%vs. 75.0%,p= 1.0）。

3.3. 安全性結(jié)果

TZV組中有6人（23.1%）發(fā)生不良事件，少于安慰劑組的10人（38.5%）（表3）。TZV組報道有惡心和嘔吐（11.5%）、低白蛋白血癥（3.8%）、粒細(xì)胞減少癥（3.8%）、電解質(zhì)紊亂（3.8%）以及反酸和腹部不適（3.8%），而安慰劑組出現(xiàn)貧血（11.5%）、腹瀉（7.7%）和低鉀血癥（7.7%）。

表1 受試者的人口學(xué)和基線特征

圖2. 臨床改善的生存曲線、肺部感染的明顯吸收和病毒核酸轉(zhuǎn)陰的時間。（a）顯示生存曲線與臨床改善比例；（b）肺CT檢查顯示肺部感染明顯吸收；（c）通過RT-PCR顯示在48 h內(nèi)連續(xù)兩次病毒核酸轉(zhuǎn)陰的比例。

本研究中共有9名受試者發(fā)生嚴(yán)重不良事件，其中，TZV組發(fā)生4件，安慰劑組發(fā)生5件。TZV組中的1名受試者在服用研究藥物后出現(xiàn)了心律不齊。安慰劑組中有1人死亡，而TZV組中并未出現(xiàn)死亡病例。本研究中死亡的患者是一名70歲的男性，入組當(dāng)天他的病情就出現(xiàn)惡化，血氧飽和度下降到83%。將氧氣的流量調(diào)整為7 L·min–1時，他的血氧飽和度保持在90%，氧合指數(shù)小于300 mmHg。肺CT顯示有嚴(yán)重的肺部感染，肺部陰影面積達(dá)75%。入組第二天，該患者被轉(zhuǎn)入ICU，且他的病情繼續(xù)惡化，出現(xiàn)了嚴(yán)重的呼吸和循環(huán)衰竭。該患者在隨機(jī)后的第三天死亡（表3）。

4. 討論

我們這項(xiàng)隨機(jī)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于安慰劑，TZV和標(biāo)準(zhǔn)療法的聯(lián)合應(yīng)用并不能在統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯改善COVID-19患者的臨床結(jié)局。這種陰性結(jié)果可能部分歸因于研究樣本量較小。

本研究的優(yōu)勢在于它是一項(xiàng)加載試驗(yàn)，由國內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)療法聯(lián)合研究藥物或安慰劑組成。這種設(shè)計(jì)確保了方案的依從性，并使參與該試驗(yàn)的受試者利益最大化。本試驗(yàn)也存在局限性。首先，所有臨床癥狀和體征的評估均由當(dāng)?shù)匮芯咳藛T進(jìn)行，他們主要從事臨床急救工作，且事先沒有接受標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的培訓(xùn)。其次，由于需要快速且及時的檢查來監(jiān)測每名患者的病情，且考慮生物樣本運(yùn)輸?shù)陌踩詥栴}，本研究未采用中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行血樣本統(tǒng)一檢測。再次，本研究樣本量較小。由于該RCT是在黑龍江省內(nèi)設(shè)計(jì)并實(shí)施的，且COVID-19在國內(nèi)屬于時限性疾病，并沒有足夠的新增病例來完成本研究的計(jì)劃樣本量。

就本研究中TZV的總體療效而言，TZV組中臨床改善的患者比例幾乎是安慰劑組的兩倍，并且TZV組臨床改善的中位時間比安慰劑組縮短了5 d。TZV組維持24 h和72 h的退熱率均高于安慰劑組。實(shí)際上，到隨訪期結(jié)束時，除了肺CT顯示肺部炎癥吸收緩慢外，所有患者的體溫、呼吸頻率、血氧飽和度和咳嗽均恢復(fù)正常。此外，TZV組在血常規(guī)中性粒細(xì)胞百分率、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分率和血清CRP水平的恢復(fù)率較高（表S2）。這些結(jié)果與TZV組使用以下合并藥物相對較少一致，包括抗菌藥物、羥氯喹、抗真菌藥、糖皮質(zhì)激素和非甾體類抗炎藥的使用（表3和表S3）。

COVID-19患者的臨床癥狀包括SARS-CoV-2感染和肺部炎癥。考慮到藥物的抗病毒作用，TZV組病毒轉(zhuǎn)陰率達(dá)到92.3%，比安慰劑組高10%。TZV組患者肺CT結(jié)果顯示，經(jīng)TZV治療后其肺部炎癥吸收人數(shù)比例更高，吸收時間更短，肺部炎性病變面積減少。此外，常規(guī)的氧氣支持、鎮(zhèn)咳/平喘/祛痰藥物使用頻率在TZV組均較低，這表明了TZV對呼吸道癥狀有改善作用。

TZV治療可促進(jìn)血清中膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、白蛋白和尿酸水平的恢復(fù)，并減少電解質(zhì)注射液和利尿劑的使用，表明該藥物對肝腎功能的損傷較小。血漿纖維蛋白原水平增高是高凝狀態(tài)的一個重要危險因素。COVID-19患者在早期D-二聚體的升高與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而D-二聚體急劇上升并伴有呼吸衰竭提示可能產(chǎn)生“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。本研究中，TZV治療后D-二聚體的恢復(fù)率達(dá)到20.0%，而安慰劑組的恢復(fù)率為零。此外，TZV的療效也表現(xiàn)在抗血小板和抗凝藥使用較少。

表3 不良事件、嚴(yán)重不良事件與合并治療

本研究中，TZV組的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）的恢復(fù)率幾乎是安慰劑組的兩倍。曾有研究顯示，心肌損傷是COVID-19一個重要的并發(fā)癥，包括在沒有肺炎癥狀和體征的COVID-19患者中[13]。此外，TZV組擴(kuò)容劑、降壓藥和擴(kuò)張血管以改善微循環(huán)的藥物使用頻率均有下降。因此，TZV治療可能通過減少心肌損傷而使COVID-19患者獲益?？傊?，由于其抗病毒特性，TZV可能對COVID-19患者的肺臟、心臟、腎臟、肝臟功能和凝血功能有改善作用。需要更大樣本量的研究來驗(yàn)證這些結(jié)果。

5. 結(jié)論

在該項(xiàng)初步研究中，TZV顯示出其對COVID-19潛在的抗病毒作用，主要體現(xiàn)在減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕對重要器官的損傷，減少對支持治療的需求等方面。

致謝

我們對直接參加本研究的一線臨床醫(yī)生深表謝意。本研究得到了中國工程院“抗擊COVID-19計(jì)劃”（2020-KYGG-01-04）和黑龍江省科技廳“新型冠狀病毒感染的肺炎疫情應(yīng)急防治診療技術(shù)研究”的支持。本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)與安全監(jiān)測委員會成員包括李康、張勇、劉松江和石耀輝。

Compliance with ethics guidelines

Xiaoke Wu, Kaijiang Yu, Yongchen Wang, Wanhai Xu,Hongli Ma, Yan Hou, Yue Li, Benzhi Cai, Liying Zhu, Min Zhang, Xiaoli Hu, Jingshu Gao, Yu Wang, Huichao Qin,Wenjie Wang, Mingyan Zhao, Xia Wu, Yong Zhang, Lu Li,Kang Li, Zhimin Du, Ben Willem J. Mol, and Baofeng Yang declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.08.011.