馬銘悅, 韓 毅

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

番茄的種植較為廣泛,營養(yǎng)豐富、口感獨(dú)特,是大家喜愛的農(nóng)作物,但是番茄極其容易染病,常見的細(xì)菌性病害主要有青枯病、潰瘍病、細(xì)菌性斑疹、瘡痂病、細(xì)菌性髓部壞死病、番茄軟腐病、番茄假單孢果腐病等[1],其中丁香假單胞菌[2]是引起植物細(xì)菌性病害之首。在番茄種植過程中，利用大量噴灑農(nóng)藥殺死病原菌的傳統(tǒng)方法會對人類造成傷害,因此基因改造已經(jīng)成為植物抗病的主要手段[3]。

對植物而言，活性氧是一類有毒的化學(xué)物質(zhì)逐漸被質(zhì)疑,取而代之的是其在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用,例如根毛發(fā)育[4]、次生壁分化與發(fā)育[5]、柱頭與花粉粒發(fā)育[6],甚至在植物面臨各種非生物脅迫(如干旱[7]、炎熱、土壤鹽漬[8])和生物脅迫[9]時作為重要的信號分子在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著作用。在植物中,活性氧能夠調(diào)控寄主對病原體的抗病反應(yīng)[10],這為植物抗病提供了思路。H2O2以比較穩(wěn)定的一種活性氧形式[11]存在于植物體內(nèi)。H2O2清除系統(tǒng)主要是非酶促反應(yīng)清除系統(tǒng)和酶促清除系統(tǒng),非酶促清除系統(tǒng)是通過抗壞血酸[12]、谷胱甘肽[13]、類胡蘿卜素等抗氧化化學(xué)物質(zhì)。酶促清除系統(tǒng)則是由過氧化氫酶(CAT)[14]、抗壞血酸過氧化物酶(APX)[15]、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)[16]、谷胱甘肽還原酶(GR)[17]等組成,其中CAT是H2O2最直接最主要的清除酶。但是光呼吸產(chǎn)生的H2O2作為抗病信號[18],往往以模式植物為研究對象[19],相關(guān)番茄的H2O2突變體報(bào)道并不多,因此番茄H2O2突變體是否提高抗病性和產(chǎn)量還不是很清楚。

甲基磺酸乙酯和T-DNA插入是使用比較普遍的隨機(jī)插入的基因突變技術(shù),但是通過這些方法得到的遺傳材料需要大量篩選,且不能定點(diǎn)突變[20]。鋅指核酸酶(ZFNs)[21]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶(TALENs)[22]雖然可以對基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯,但是構(gòu)建DNA結(jié)構(gòu)域的表達(dá)單位比較復(fù)雜、過程繁瑣。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)核酸酶9系統(tǒng)(CRISPR/Cas9)[23]由sgRNA(single guide RNA)和Cas9組成,sgRNA[24]根據(jù)靶點(diǎn)基因?qū)ふ业较嗥ヅ涞腄NA片段、Cas9蛋白切割序列[25],DNA 通過容易出錯的非同源末端連接修復(fù)[26]后,基因發(fā)生改變。這樣的定點(diǎn)基因編輯技術(shù)構(gòu)建載體方便快捷高效且現(xiàn)在技術(shù)逐漸成熟,有更多有效的切割蛋白[27]出現(xiàn),極大地提高了基因敲除效率。因此本文構(gòu)建番茄的CAT基因多靶點(diǎn)敲除系統(tǒng)并篩選出陽性苗,為后期研究H2O2抗病提供了遺傳材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)室所用野生番茄(Solanumlycopersicum)野生型Ailsa Craig(AC)來自美國康奈爾大學(xué)THOMPSON植物研究所,由本實(shí)驗(yàn)繁殖育種。表達(dá)盒質(zhì)粒pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29,質(zhì)粒pYLCRISPR/Cas9P35s-N均來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光實(shí)驗(yàn)室[28]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

試劑主要有MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂粉、酵母提取物、牛肉膏、無水乙醇、高樂氏(主要成分是次氯酸鈉)、BsaⅠ限制性內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶、T4連接酶、質(zhì)粒提取純化試劑盒等。

主要儀器有高溫高壓滅菌鍋、離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、一次性培養(yǎng)板等。

1.2 方法

1.2.1 目的基因與表達(dá)盒組合擴(kuò)增

在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的網(wǎng)站(http://skl.scau.edu.cn/home/)上輸入基因信息,設(shè)計(jì)4個靶點(diǎn)引物后合成,稀釋成100倍的母液,F與R 混合并稀釋到1 mol/L。pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29質(zhì)粒圖[28]如圖1所示,這4個質(zhì)粒酶切后的產(chǎn)物分別與對應(yīng)的混合引物在T4連接酶的作用下反應(yīng)45～60 min。通過巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)對連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.2 目的基因雙元載體構(gòu)建

對擴(kuò)增后的4個表達(dá)盒分別進(jìn)行純化,以減少后續(xù)不良反應(yīng)影響。把純化的產(chǎn)物與質(zhì)粒pYLCRISPR/Cas9P35s-N按照一定摩爾比加入邊切邊連變溫循環(huán)酶反應(yīng)體系,pYLCRISPR/Cas9P35s-N質(zhì)粒圖[28]如圖2所示。反應(yīng)結(jié)束后把產(chǎn)物加入大腸感受態(tài)中,熱擊處理,涂布kana篩選培養(yǎng)基,12 h后挑單克隆并進(jìn)行菌落PCR鑒定。確定陽性菌后提取質(zhì)粒且送去測序并轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌,保存甘油菌備用。

圖2 CRISPR/Cas9載體

1.2.3 番茄愈傷組織的培養(yǎng)

在無菌操作臺,將浸泡在無菌水約6 h的AC種子,75%乙醇消毒5 min,15%高樂氏15 min,無菌水5 min重復(fù)10次。在滅菌后的濾紙上晾干后移到1/2 MS培養(yǎng)基生長。待2對子葉伸展后,剪下子葉和莖(其中子葉需要戳孔)放入預(yù)培養(yǎng)約3 d,形成愈傷組織。

1.2.4 侵染番茄愈傷組織并篩選陽性苗

將構(gòu)建的pYLCRISPR/Cas9P35s-N-CAT農(nóng)桿菌搖菌至OD值約為1.0后配制成侵染液,對愈傷組織進(jìn)行侵染并把侵染后的愈傷組織放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基。2 d后及時移苗至含有kana的篩選培養(yǎng)基,此后每20 d更換1次篩選培養(yǎng)基以及kana濃度。約40 d后,把陽性苗移到生根培養(yǎng)基,待苗生根后再移到土里。

1.2.5 陽性苗Cas9鑒定

取樣,用液氮充分研磨,加入400 mL的SDS提取液,10 000 r/min,4 ℃離心10 min,取200 mL上清與200 mL異丙醇混合,10 000 r/min,室溫離心10 min,棄上清,加75% 乙醇,10 000 r/min,室溫離心5 min。吹干后加入100 μL,無菌水。吸取2 μL DNA作為PCR的目的模板,35個PCR循環(huán):95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s。Cas9引物序列見表1所列。

表1 引物的序列

1.2.6 陽性苗酶活檢測

取樣,用液氮充分研磨,加入1 mL提取液,14 000 r/min 4 ℃離心,10 min,吸取上清放入冰上備用。反應(yīng)體系為1 mL,970 μL0.1 mol/L NaH2PO4,1 mmol/L EDTA (pH值7.5),20 μL 2 mol/L H2O2, 10 μL提取液,檢測在240 nm處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因雙元載體的構(gòu)建

本文選擇了4個靶點(diǎn),設(shè)計(jì)了靶點(diǎn)接頭引物,具體信息見表1所列。為了提高表達(dá)盒的效率,通過pYLgRNA-AtU3b與T1連接, pYLgRNA-AtU3d與T2連接,pYLgRNA-AtU6-1與T3連接,pYLgRNA-AtU6-29與T4連接,將酶切的表達(dá)盒質(zhì)粒分別與對應(yīng)靶點(diǎn)連接反應(yīng)。

為了準(zhǔn)確擴(kuò)增含目的靶點(diǎn)的表達(dá)盒,選擇巢式PCR,每個含有目的靶點(diǎn)擴(kuò)增都有2輪PCR反應(yīng),巢式PCR鑒定跑膠圖如圖3所示。第1輪用表達(dá)盒左端引物UF與靶點(diǎn)接頭R為一對引物即UF+TR的產(chǎn)物,如圖3a所示的1號泳道,靶點(diǎn)接頭F與表達(dá)盒右端引物gRNAR為一對引物即TF+gRNAR的產(chǎn)物,如圖3a所示的2號泳道,分別擴(kuò)增含目的靶點(diǎn)的表達(dá)盒。圖3a中1和2只是1個靶點(diǎn)的2個PCR結(jié)果,剩下的3個靶點(diǎn)結(jié)果應(yīng)該和圖1保持一致。

第1輪PCR的2個產(chǎn)物稀釋10倍,混合后作為第2輪PCR模板,與對應(yīng)的10倍位置特異性引物反應(yīng)做PCR，如圖3b所示。圖3b中的1、2、3、4分別對應(yīng)4個靶點(diǎn)的第2輪PCR產(chǎn)物。

圖3 巢式PCR鑒定跑膠圖

為了保證PCR產(chǎn)物后續(xù)與載體正常高效地酶切和連接,需要對第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。4個表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9P35s-N連接后,轉(zhuǎn)化大腸,挑選單克隆,進(jìn)行菌落PCR鑒定結(jié)果如圖4所示。為了準(zhǔn)確檢測目的靶點(diǎn)在載體上,菌落PCR鑒定為5對引物,即CRISPR表達(dá)盒左端引物35sF與靶點(diǎn)1的接頭R(產(chǎn)物為圖4的1號泳道),靶點(diǎn)1的接頭F與靶點(diǎn)2的接頭R(產(chǎn)物為圖4的2號泳道),靶點(diǎn)2的接頭F與靶點(diǎn)3的接頭R(產(chǎn)物為圖4的3號泳道),靶點(diǎn)3的接頭F與靶點(diǎn)4的接頭R(產(chǎn)物為圖4的4號泳道),靶點(diǎn)4的接頭F與CRISPR表達(dá)盒右端引物35sR(產(chǎn)物為圖4的5號泳道)。其中圖4的左邊空白對照的PCR模板為水。

圖4 陽性單克隆菌落PCR鑒定

挑選陽性菌落,提質(zhì)粒送去測序，測序結(jié)果如圖5所示,從圖5可看出，4個靶點(diǎn)全部與構(gòu)建的質(zhì)粒序列相匹配,這個雙元載體成功構(gòu)建,轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌為后續(xù)的侵染番茄做準(zhǔn)備。

圖5 靶點(diǎn)與雙元載體質(zhì)粒序列對比圖

2.2 番茄陽性苗篩選與鑒定

通過組織培養(yǎng)獲得番茄的愈傷組織,并用陽性農(nóng)桿菌侵染愈傷組織,經(jīng)過多次抗生素濃度提高的培養(yǎng)基來篩選出7顆陽性苗。

把7棵陽性苗移到土里培養(yǎng)一段時間后,取樣進(jìn)行Cas9鑒定和酶活測量,Cas9鑒定結(jié)果如圖6所示,圖6中,空白對照的 PCR模板為野生型,其泳道上沒有條帶,但是1～7號泳道上的條帶和構(gòu)建成功的雙元載體質(zhì)粒為模板時的條帶一樣,因此Cas9基因成功轉(zhuǎn)入陽性苗體內(nèi)。

圖6 陽性苗PCR鑒定Cas9

對其中7顆陽性苗進(jìn)行酶活測定,結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，所有的陽性苗CAT酶活顯著性地低于野生型對照,表明CRISPR/Cas9成功地敲除番茄CAT相關(guān)基因。

圖7 7顆陽性苗酶活測定

3 討論與展望

目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在動物、植物、微生物等領(lǐng)域都有一席之地,在植物上擬南芥、番茄、水稻、棉花、生菜、大豆等都能看到CRISPR/Cas9的身影[29-31]。

在CRISPR為載體的基因編輯系統(tǒng)中,sgRNA和Cas9甚至靶點(diǎn)序列的選擇都會影響打靶效率。Cas9基因密碼子、啟動子、終止子會影響Cas9的表達(dá)水平和活性[28]。靶點(diǎn)目標(biāo)帶著sgRNA與DNA識別時,會有幾個堿基的誤差,會造成脫靶[32]。CRISPR/Cas9是通過DNA雙鏈斷裂[33],形成DNA損傷,DNA自身會進(jìn)行修復(fù),但是修復(fù)過程中容易出現(xiàn)堿基對缺失或者修復(fù)錯誤，其結(jié)果千差萬別[26],從而導(dǎo)致遺傳信息的改變。因此修復(fù)能力也決定了最終突變體的類型。這些原因就導(dǎo)致最后篩到的突變體各有不同。在今后構(gòu)建載體時,需要對目的靶點(diǎn)多加篩選,提高sgRNA的特異性,改造Cas9蛋白酶都有利于減少脫靶頻率[34]。

本實(shí)驗(yàn)最終篩選出7顆陽性苗,并對其進(jìn)行CAT酶活測定。酶活有顯著性的下降,但是所有的材料還具有部分CAT酶活,表明不是所有的CAT基因被敲除,暗示CRISPR/Cas9打靶敲除了其中若干基因,而不是全部。CRISPR/Cas9敲除會導(dǎo)致堿基對的增添、缺失、突變等情況;其次,CAT相關(guān)的基因有3個,CDS序列高度相似;而且,無法找到針對其中一個CAT基因的專一性靶點(diǎn)。因此在基因水平上確定每個CAT的精確突變情況會異常困難。PCR鑒定顯示番茄體內(nèi)存在Cas9,可能會對突變體內(nèi)其他未突變的CAT繼續(xù)敲除,因此期望在后續(xù)T1和T2代中可以獲得純合CAT基因全敲除的突變體。

以丁香假單胞菌為代表的病原菌是引發(fā)疫病、導(dǎo)致番茄減產(chǎn)的主要原因[2]。植物在遭受病原菌侵害時會出現(xiàn)一種程序性死亡且激活體內(nèi)一系列抗病防御反應(yīng)[35],而光呼吸途徑代謝產(chǎn)生的H2O2能顯著抑制丁香假單胞菌對植物的侵染以及提高植物體內(nèi)免疫防御能力[36]。通過番茄CAT的CRISPR/Cas9雙元敲除載體系統(tǒng)獲得突變體,不管能否獲得全敲除的CAT突變體,本文目前獲得的CAT酶活缺失突變體為后續(xù)分析番茄的抗病性和產(chǎn)量提供了重要的遺傳材料，同時分析這些番茄突變體的遺傳穩(wěn)定性,以期獲得穩(wěn)定的且抗病能力強(qiáng)的番茄新品種。