楊 楠, 鮑 斌

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

大腸桿菌是一種生活在腸道中的細(xì)菌[1-2]。早在19世紀(jì)80年代,德國的生物學(xué)家 Escherich 就通過實(shí)驗(yàn)將大腸桿菌分離出來,自發(fā)現(xiàn)以來,越來越多的專家學(xué)者對其進(jìn)行深入研究。多年來,對大腸桿菌的研究主要有醫(yī)學(xué)和物理化學(xué)2個(gè)方向,主要針對大腸桿菌的檢測方法進(jìn)行研究[3]。除此之外,在實(shí)驗(yàn)室中,大腸桿菌還可用作秀麗隱桿線蟲的食物來源。

秀麗隱桿線蟲個(gè)體簡單,存在雄蟲和雌雄同體2種狀態(tài)。雌雄同體成蟲體細(xì)胞有959個(gè)細(xì)胞,雄蟲成蟲1 031個(gè)體細(xì)胞[4]。線蟲具有飼養(yǎng)條件簡單、易操作、生命周期較短以及遺傳操作便利等優(yōu)勢,因此成為生物學(xué)研究中的重要模式動(dòng)物。在野外,線蟲以生存環(huán)境中的各種細(xì)菌為食物來源[5-6],然而在實(shí)驗(yàn)室中主要以大腸桿菌為食[7]。實(shí)驗(yàn)室中用于喂養(yǎng)線蟲的大腸桿菌主要有OP50、 HT115、 HB101、 MG1655。大腸桿菌菌株OP50形成的是一個(gè)薄的菌落,可以最佳地展示秀麗隱桿線蟲的發(fā)育[8];MG1655是可誘導(dǎo)耐高壓菌株,且近年在以線蟲為模式生物來研究腸道菌群代謝中逐漸被采用[9]；HB101是一種B x K12雜種,可形成比OP50明顯更厚的菌落[10],相比于其他大腸桿菌而言是線蟲最喜愛的菌株;HT115(DE3)是一種K12衍生的RNAse Ⅲ菌株,常被用作進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)[11-12]。

由于線蟲的發(fā)育周期短,一般3 d左右,基本生理指標(biāo)易受飲食的影響[13]。為了研究不同大腸桿菌對線蟲生長發(fā)育的影響,本文對實(shí)驗(yàn)室中常用的不同大腸桿菌品系的營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量、能量和總能量,及其對線蟲進(jìn)食速率、發(fā)育速率、生殖能力、壽命進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌菌株OP50、 MG1655、 HT115、 HB101均來自于本實(shí)驗(yàn)室；野生型秀麗隱桿線蟲(N2)購自國際線蟲中心(CGC)。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、油紅O、BCA均購自Sigma試劑公司；氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、無水乙醇、苯酚、硫酸、石油醚、1,2-丙二醇等試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大腸桿菌的培養(yǎng)

液體LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基1 L中,需稱取10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g氯化鈉,121 ℃,滅菌30 min。將大腸桿菌接種到冷卻后的LB后放置搖床中,37 ℃,220 r/min,培養(yǎng)12 h。接種時(shí)需要根據(jù)大腸桿菌的抗性添加1/1 000相應(yīng)的抗生素：OP50添加30 g/L鏈霉素,HT115添加100 g/L氨芐青霉素,MG1655、HB101不添加抗生素。

1.3.2 線蟲的培養(yǎng)

線蟲生長型培養(yǎng)基(nematode growth medium, NGM)的配置。600 mL NGM培養(yǎng)基中需稱取瓊脂粉12 g、氯化鈉1.8 g、蛋白胨1.5 g；加蒸餾水585 mL,121 ℃,滅菌30 min；冷卻到65 ℃后分別加入600 μL的1 mol/L MgSO4、1 mol/L CaCl2、5 g/L膽固醇,磷酸鉀緩沖液15 mL,根據(jù)大腸桿菌抗性添加抗生素同1.3.1所述,混勻后倒板。

線蟲的同步化。將正在產(chǎn)卵的線蟲用M9緩沖液洗至1.5 mL離心管中,自由沉降,多次使用M9去除大腸桿菌,最后留約700 μL M9;加入現(xiàn)配5 mol/L NaOH和5%NaClO體積比為1:2混合的裂解液300 μL,混合均勻;震蕩,反復(fù)2次,約5 min觀察到蟲子裂解至2/3后立即6 000 r/min離心1 min 30 s,棄上清;用M9洗2遍,將卵鋪在含有大腸桿菌的NGM培養(yǎng)基上。

1.3.3 大腸桿菌3種營養(yǎng)物質(zhì)的檢測

碳水化合物的檢測采用苯酚-硫酸法。稱取葡萄糖于60 ℃烘箱烘12 h至恒重,再稱取恒重后的葡萄糖配制100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確吸取100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于干燥的試管中,補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL。 同時(shí)取1.0 mL待測大腸桿菌菌液至干燥的試管中;吸取25 μL的80%苯酚,快速?zèng)_洗待測液,加入2.5 mL濃硫酸,在旋渦混合器上混合15 s,35 ℃反應(yīng)15 min,降溫至再次震蕩混合不再放熱即可,在波長490 nm處測吸光度,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與相對應(yīng)的OD490值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)大腸桿菌OD490值、大腸桿菌總體積、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得知所測大腸桿菌含葡萄糖的總質(zhì)量,通過平板菌落計(jì)數(shù)法(CFU)統(tǒng)計(jì)待測大腸桿菌總個(gè)數(shù),大腸桿菌的葡萄糖總質(zhì)量與大腸桿菌總個(gè)數(shù)的比值即為每個(gè)大腸桿菌中葡萄糖的質(zhì)量。

蛋白質(zhì)的檢測中采用Bradford法。細(xì)菌蛋白提取:在4 ℃,12 000 r/min下菌液離心5 min,棄上清,收集菌體,用PBS洗菌體2次,按每20 mg濕重菌體加入500 μL蛋白酶抑制劑體積比1∶100)及磷酸酶抑制劑(體積比1∶100)預(yù)冷的蛋白裂解液,吹打混勻,冰上放置30 min；300 W,10 s超聲,10 s間隔,冰浴超聲至菌液變清；4 ℃,12 000 r/min 菌液離心5 min,上清轉(zhuǎn)入冷的干凈離心管,即得到細(xì)菌蛋白。

制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線:向干凈滅菌的EP管中依次加入0.5 g/L牛血清白蛋白(BSA)0、5、15、20、25、30 μL,分別加入雙蒸水補(bǔ)至100 μL,混勻,然后各個(gè)試管中分別加入1 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,立即混勻,不要太劇烈；2 min后,測定各個(gè)樣品在595 nm處的光吸光值,空白對照為一號(hào)EP管,以蛋白質(zhì)量濃度和吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定。把待測樣品稀釋至10～100 μg/mL,取50 μL稀釋后的樣品,加入150 μL考馬斯亮藍(lán),后續(xù)步驟同上,測得A595值后,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到對應(yīng)的質(zhì)量濃度。根據(jù)樣品質(zhì)量濃度、體積得到樣品總蛋白質(zhì)量。因此依據(jù)大腸桿菌的總蛋白、總個(gè)數(shù)可得到每個(gè)大腸桿菌的蛋白質(zhì)量。

脂肪的檢測采用索氏提取法。大腸桿菌菌液置于蒸發(fā)皿中,加入約20 g石英砂,于沸水浴上蒸干后,在電熱鼓風(fēng)干燥箱中于100 ℃干燥30 min后取出,全部移入濾紙筒內(nèi)。抽提:將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi),連接已干燥至恒重的接收瓶,由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶內(nèi)容積的2/3處,于水浴上加熱,使石油醚不斷回流抽提(6 ～8次/h),抽提10 h。提取結(jié)束時(shí),用磨砂玻璃棒接取1滴提取液,磨砂玻璃棒上無油斑表明提取完畢。稱量:取下接收瓶,回收石油醚,待接收瓶內(nèi)溶劑剩余1 ～2 mL時(shí)在水浴上蒸干,再于100 ℃干燥1 h,放干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱量。重復(fù)以上操作直至恒重。

1.3.4 線蟲發(fā)育相關(guān)指標(biāo)的檢測

發(fā)育速率。挑取20～30條正在產(chǎn)卵的線蟲,放在NGM上自由產(chǎn)卵20 min,大約有30顆卵產(chǎn)生時(shí),移除產(chǎn)卵的線蟲，記錄時(shí)間為T0。30顆卵產(chǎn)生第1顆卵時(shí)間為Tn。Tn與T0的時(shí)間差即為線蟲發(fā)育所需的時(shí)間。

壽命統(tǒng)計(jì)。準(zhǔn)備普通NGM培養(yǎng)基和FUDR NGM培養(yǎng)基2種,加入等量的4種大腸桿菌,挑取20～30條正在產(chǎn)卵的線蟲放入含有大腸桿菌的普通NGM培養(yǎng)基上,20 ℃,讓其自由產(chǎn)卵,待其產(chǎn)卵大于50顆時(shí),將成蟲挑走;上述NGM培養(yǎng)基板20 ℃培養(yǎng),卵自由發(fā)育至L4時(shí)期,此時(shí)線蟲轉(zhuǎn)到FUDR的NGM培養(yǎng)基上,2～3 d換1次FUDR培養(yǎng)基,并統(tǒng)計(jì)線蟲死亡數(shù)目,直至每組樣本線蟲全部死亡。

進(jìn)食速率統(tǒng)計(jì)。在光學(xué)顯微鏡100倍條件下,隨機(jī)選取發(fā)育至早期成蟲時(shí)期的線蟲,于30 s記1次時(shí)間,統(tǒng)計(jì)線蟲咽部的跳動(dòng)速率,每條線蟲重復(fù)3次,每1組樣本挑取10～20條線蟲。

產(chǎn)卵量統(tǒng)計(jì)。準(zhǔn)備直徑30 mm食物充足的NGM培養(yǎng)基,挑取1條早期成蟲時(shí)期的線蟲放入NGM中,從第1天產(chǎn)卵開始,記錄每天產(chǎn)卵數(shù)目,并轉(zhuǎn)移該條線蟲到新的NGM上,直至線蟲不再產(chǎn)卵,所有天數(shù)產(chǎn)卵之和即為該條線蟲的產(chǎn)卵量,每組樣本數(shù)30條,重復(fù)3次。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±se)表示,重復(fù)3次。不同組之間使用t檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品系大腸桿菌的營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量水平

當(dāng)4種大腸桿菌作為線蟲食物時(shí),需要對4種大腸桿菌的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分析。因此本文對4種大腸桿菌每個(gè)菌株所含的三大營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行了檢測,結(jié)果如圖1所示。

由圖1a可知,4種大腸桿菌中每個(gè)菌株中碳水化合物的質(zhì)量從高到低依次為MG1655、 HT115、HB101、OP50。因此在這4種大腸桿菌中,MG1655為碳水化合物質(zhì)量較高的菌株,OP50為較低的菌株。由圖1b可知,4種大腸桿菌的蛋白質(zhì)質(zhì)量沒有顯著性差異,因此若依據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量量的高低為選擇標(biāo)準(zhǔn),則無法區(qū)分4種菌株。由圖1c可知,通過對脂肪質(zhì)量的檢測,HB101菌株脂肪質(zhì)量最高,且遠(yuǎn)高于其他3種大腸桿菌,OP50與HT115在脂肪質(zhì)量上相近,且兩者大于HT115。同時(shí),從圖1整體來對比3種營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量,可以看出碳水化合物的質(zhì)量最高,其次是蛋白質(zhì),最后是脂肪。因此,不同的大腸桿菌含有的營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量不同。

圖1 4種大腸桿菌中的3種營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量

2.2 不同品系大腸桿菌的營養(yǎng)物質(zhì)能量水平

本文對4種大腸桿菌營養(yǎng)物質(zhì)能量情況進(jìn)行分析。將碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪3種產(chǎn)能營養(yǎng)物質(zhì)的含量水平乘以各自相應(yīng)的能量系數(shù),即碳水化合物、蛋白質(zhì)的能量系數(shù)均為16.7 kJ/g,脂肪的能量系數(shù)為37.9 kJ/g,計(jì)算得出3種產(chǎn)能營養(yǎng)物質(zhì)的能量。4種大腸桿菌的3種產(chǎn)能營養(yǎng)物質(zhì)能量情況如圖2所示。由圖2a可知,在碳水化合物能量中MG1655最高,其次是HT115,再其次是HB101、最后是OP50。由圖2b可知,在蛋白質(zhì)所含能量中,3種營養(yǎng)物質(zhì)沒有顯著差異。由圖2c可知,在能量系數(shù)最高的脂肪中,HB101的能量最高,且遠(yuǎn)高于其他三者;OP50與HT115相似,同時(shí)高于MG1655。將3種營養(yǎng)物質(zhì)的能量加和得出4種大腸桿菌的總能量，如圖2d所示。由圖2d可知,在總能量從高到低依次為MG1655、HT115、 HB101、OP50。通過對圖2a、圖2b、圖2c的對比,3種供能營養(yǎng)物質(zhì)能量系數(shù)最高的是脂肪,由于含量最少,因此能量也最少。由圖2可知,4種大腸桿菌的總能量與碳水化合物能量的趨勢一致。綜上所述,4種大腸桿菌在碳水化合物的能量、蛋白質(zhì)的能量、脂肪的能量以及總能量上都不同,主要由碳水化合物提供能量,且菌株總能量的水平也由碳水化合物決定。

圖2 4種大腸桿菌中的3種營養(yǎng)物質(zhì)的能量

2.3 不同品系大腸桿菌對線蟲發(fā)育的影響

鑒于4種大腸桿菌的能量不同,有可能會(huì)影響線蟲的進(jìn)食速率。本文首先調(diào)查了食用上述4種大腸桿菌的線蟲進(jìn)食速率,本文以單位時(shí)間內(nèi),線蟲咽部跳動(dòng)的次數(shù)視為線蟲的進(jìn)食速率，如圖3所示,由圖3可知,食用4種大腸桿菌的線蟲的咽部跳動(dòng)速率沒有顯著性差異,即進(jìn)食速率沒有差異,所以大腸桿菌的能量差異不改變線蟲的進(jìn)食量。

圖3 4種大腸桿菌對線蟲進(jìn)食速率的影響

本文研究了線蟲的生命周期長度,結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出,即線蟲從卵開始孵化,發(fā)育直至再發(fā)育成成蟲并產(chǎn)出第1顆卵的時(shí)間,發(fā)現(xiàn)食用HT115的線蟲與食用OP50的線蟲生命周期長度相類似,而食用MG1655或HB101的線蟲生命周期較短,說明MG1655與HB101可以加快線蟲的發(fā)育速率。

圖4 4種大腸桿菌對線蟲發(fā)育速率的影響

本文分析4種大腸桿菌對線蟲壽命的影響如圖5所示。由圖5可知,食用不同的大腸桿菌在對線蟲壽命上沒有影響。

圖5 4種大腸桿菌對線蟲壽命的影響

本文通過統(tǒng)計(jì)線蟲的產(chǎn)卵量對線蟲的生殖能力進(jìn)行了研究,結(jié)果如圖6所示。

圖6 4種大腸桿菌對線蟲產(chǎn)卵量影響

由圖6可知,與OP50比較,食用MG1655、HT115、HB101的線蟲的產(chǎn)卵量沒有區(qū)別。但是食用HT115的線蟲較HB101有較多的產(chǎn)卵量,因此HT115的生殖能力高于HB101。

3 結(jié) 論

本文首先采用食品檢測的方法分析了實(shí)驗(yàn)室常用4種大腸桿菌的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪的質(zhì)量、能量以及總能量。本文發(fā)現(xiàn)雖然不同的菌種具有不同量的營養(yǎng)物質(zhì),如HB101含有的蛋白質(zhì)、脂肪最多,MG1655中的碳水化合物質(zhì)量最多,但是在4種菌種中含量最高的營養(yǎng)物質(zhì)是碳水化合物,是蛋白質(zhì)的數(shù)十倍,脂肪的上千倍,因此總能量水平主要是由碳水化合物決定的。

本文進(jìn)一步對食用4種大腸桿菌的線蟲的進(jìn)食速率、發(fā)育速率、壽命以及生殖能力進(jìn)行探究,結(jié)果表明與OP50相比,其他3種大腸桿菌對線蟲的進(jìn)食速率、壽命、生殖能力沒有影響。在發(fā)育速率方面,MG1655、HB101喂養(yǎng)的線蟲比OP50喂養(yǎng)的發(fā)育速率快。在生殖能力上,食用HT115比食用HB101的線蟲生殖能力強(qiáng)。HB101有最高的脂肪含量,且食用HB101的線蟲有較快的發(fā)育速率以及較差的生殖能力,因此線蟲的發(fā)育速率、生殖能力可能受到了脂肪的調(diào)控。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,其他營養(yǎng)物質(zhì)對線蟲的發(fā)育沒有顯著影響。但是本文提供的營養(yǎng)物質(zhì)能量是根據(jù)各營養(yǎng)物質(zhì)的能量系數(shù)得來的理論能量,不能代表線蟲實(shí)際攝入能量情況,因此營養(yǎng)物質(zhì)的能量對于線蟲的影響需進(jìn)一步研究。

本文的研究模型中線蟲是自由進(jìn)食的,可視為能量攝入是充足的,因此即使不同細(xì)菌的能量、含量不同,也未必能夠改變線蟲的發(fā)育速率及脂肪沉積的表型,并且細(xì)菌對宿主代謝的影響是復(fù)雜的,極有可能是通過一些特定代謝物(如脂肪酸、膽固醇[14]等)作為信號(hào)分子,對宿主進(jìn)行調(diào)控,這些還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的探究。