李四維 林丹櫻 鄒小慧 張煒陳丹妮 于斌? 屈軍樂?

1) (深圳大學物理與光電工程學院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室,深圳 518060)

2) (廣東省科學院航空裝備研究所,珠海 519000)

在傳統(tǒng)共聚焦顯微技術的基礎上,圖像掃描顯微技術使用面陣探測器來代替單點探測器,結合虛擬數(shù)字針孔并利用像素重定位和解卷積圖像重構算法將傳統(tǒng)寬場顯微鏡的分辨率提高一倍,實現(xiàn)了高信噪比的超分辨共焦成像.但是,由于采用逐點掃描的方式,三維成像速度相對較慢,限制了其在活體樣品成像中的應用.為了進一步提高圖像掃描顯微術的成像速度,本文提出了一種基于雙螺旋點擴散函數(shù)工程的多焦點圖像掃描顯微成像方法和系統(tǒng).在照明光路中,利用高速數(shù)字微鏡器件產(chǎn)生周期分布的聚焦點陣對樣品進行并行激發(fā)和快速二維掃描; 在探測光路中,利用雙螺旋相位片將激發(fā)點熒光信號的強度分布轉換為雙螺旋的形式;最終,利用后期數(shù)字重聚焦處理,從單次樣品掃描數(shù)據(jù)中重構出多個樣品層的超分辨寬場圖像.在此基礎上,利用搭建的系統(tǒng)分別對纖維狀肌動蛋白和海拉細胞線粒體進行成像實驗,證明了該方法的超分辨能力和快速三維成像能力.

1 引 言

激光掃描共聚焦顯微 (confocal laser scanning microscopy,CLSM)技術[1?3]具有良好的成像分辨率和層析能力,被廣泛應用于生命科學研究.在傳統(tǒng)的CLSM 系統(tǒng)中,利用單個衍射受限的聚焦點對樣品進行二維掃描,并在探測光路中放置針孔來阻擋來自樣品離焦位置的熒光信號.雖然選用尺寸極小的針孔可以有效地提高CLSM 的成像分辨率,但同時也會阻擋大部分熒光信號,造成圖像信噪比(signal-to-noise ratio,SNR)大幅下降.因此,在實際應用中,針孔尺寸通常選擇為一個艾里斑的大小,通過犧牲分辨率來確保系統(tǒng)的最佳SNR.為了解決這一問題,Sheppard[4]于1988 年提出了像素重定位理論,利用面陣探測器代替CLSM 中的單像素探測器,通過后期像素重定位的數(shù)據(jù)處理來獲得高SNR 的超分辨圖像.但受限于當時的硬件技術,直到20 多年后該理論才被Müller 和Enderlein[5]實驗驗證,并將該技術命名為圖像掃描顯微(image scanning microscopy,ISM)技術[6?8],其在保持高SNR 的同時將成像分辨率提升至寬場照明成像的2 倍.Jesacher 等[9]和Roider 等[10]將雙螺旋點擴散函數(shù)(double-helix point spread function,DH-PSF)工程技術與ISM 結合,提出了一種基于螺旋相位工程的數(shù)字重聚焦掃描顯微(refocusing after scanning using helical phase engineering,RESCH)技術,其在探測光路中引入DH-PSF 相位片,將樣品發(fā)射的高斯熒光點轉換成雙螺旋的形式; 在此基礎上,利用DH-PSF 的軸向定位特性和后期數(shù)字重聚焦處理方法,RESCH 能夠從單次二維掃描的數(shù)據(jù)中獲得軸向400 nm 范圍內樣品不同層的結構信息,大幅提升了ISM 的三維成像速度.隨后,該研究組對RESCH 進行了改進,將PSF工程同時應用于照明和探測光路,提出了一種工程化的ISM (engineered ISM)[11],該方法將RESCH的軸向探測范圍擴展到2 μm,進一步減少了ISM的三維成像所需要的時間.雖然這些方法能夠有效提高ISM 的三維掃描成像速度,但受到電荷耦合器件(CCD)像素信號讀取時間和單聚焦點激發(fā)模式的限制,其對尺寸為8 μm×8 μm 樣品區(qū)域的成像時間約為1 min,遠不能滿足活體細胞的動態(tài)觀測.2017 年,Wang 等[12]將螺旋相位工程應用于傳統(tǒng)的寬場照明顯微系統(tǒng)中,提出了一種三維寬場熒光成像顯微技術,該技術僅需要單次相機曝光即可獲得一定軸向范圍內的樣品結構信息,雖然具有較高的時間分辨率,但是由于成像分辨率和層析能力較差,僅適用于稀疏結構的薄生物樣品成像.2018 年,本課題組[13]將螺旋相位工程與多焦點結構光顯微(multifocal structured illumination microscopy,MSIM)技術[14]相結合,提出了一種快速三維超分辨顯微方法,命名為MSIMH (MSIM with helical phase engineering),該技術利用DH-PSF的軸向深度編碼特性、反卷積和像素重定位算法,實現(xiàn)了無需軸向掃描即可快速獲取焦深范圍內樣品結構的超分辨三維圖像,但是由于軸向重疊部分的樣品信息會在重構中丟失,因此,該重構方法無法適用于結構較為密集的生物樣品成像,需要進一步發(fā)展新的超分辨重構算法來擴展MSIMH 的應用場景.

為了解決上述問題,在RESCH 和MSIMH 的基礎上,本文提出一種基于多焦點結構光照明的RESCH,命名為MRESCH,該技術在RESCH的照明光路中引入了數(shù)字微鏡器件(digital micromirror device,DMD),能夠對樣品面上的光強進行調制,產(chǎn)生周期分布的聚焦點陣,實現(xiàn)樣品不同位置的同時激發(fā),大幅提高了系統(tǒng)的成像速度.在探測光路中,雙螺旋相位工程的引入將標準點擴散函數(shù)轉換為雙螺旋的形式,并且結合后期的數(shù)字重聚焦處理,從單次二維掃描圖像堆棧中重構出樣品在不同軸向位置的結構信息,大幅減少三維測量的時間.最終,使用搭建的MRESCH 系統(tǒng)對纖維狀肌動蛋白和海拉細胞的線粒體進行成像實驗,驗證了方法的可行性和成像效果.

2 MRESCH 的基本原理

2.1 MRESCH 的光路設計

MRESCH 的光路示意圖如圖1(a)所示,在照明光路中,波長為488 nm 的激光經(jīng)4f 系統(tǒng)準直擴束后直接照射到DMD 面板上,其入射角與DMD 面板呈24°; 接著,激光經(jīng)DMD 調制后進入后續(xù)的4f 系統(tǒng),其傅里葉面位置上的光闌可以有效阻止多余衍射級的光進入顯微系統(tǒng).最后,4f 后焦面位置形成的聚焦點陣經(jīng)過管鏡和物鏡縮小后重新聚焦到樣品面上,尺寸為原來的1/90.本文實驗中所使用的DMD 面板的像素個數(shù)為1024 ×768,像素尺寸為10.8 μm×10.8 μm,對應到樣品面上的尺寸為120 nm×120 nm.在探測光路中,樣品發(fā)出的熒光經(jīng)物鏡(尼康,60×,NA = 1.27水鏡)和管鏡收集后,然后通過具有雙螺旋相位片的4f 系統(tǒng),最后成像在科學級互補金屬氧化物半導體探測器(sCMOS,濱松,ORCA Flash 4.0 V2)上.其中,雙螺旋相位片放置在4f 系統(tǒng)的傅里葉面位置,與物鏡的后焦面呈共軛關系,雙螺旋相位片能夠對探測系統(tǒng)的傳遞函數(shù)進行調制,將標準PSF 轉換為DH-PSF 的形式.DH-PSF 是一種特殊的三維點擴散函數(shù),常用于細胞內分子的三維定位和成像[15?18],當分子的軸向位置發(fā)生改變時,DH-PSF 的兩個旁瓣會圍繞著光軸進行旋轉,如圖1(b)所示,因此,可以通過兩個旁瓣之間的相對旋轉角度來精確確定分子的軸向位置.目前,DHPSF 相位片的設計有多種方法[19?22],本文根據(jù)文獻[19]中的方法進行設計,并利用熒光珠樣品來標定DH-PSF 旋轉角度θ與樣品激發(fā)位置z的線性關系k,如圖1(c)所示,經(jīng)計算DH-PSF 旋轉180°對應樣品的軸向位移Δz約為5.5 μm.

2.2 MRESCH 的成像原理

在MRESCH 系統(tǒng)中,將特定的投影模式(見圖2(a))載入DMD 來產(chǎn)生周期分布的聚焦點陣對樣品進行照明激發(fā),在樣品面的強度分布如圖2(b)所示.當投影模式切換時,“on”像素的位置將沿紅色軌跡進行移動(1 pixel/step),實現(xiàn)樣品的快速掃描.其中單個激發(fā)熒光點在探測面上的強度分布可以表示為

其中ρ表示樣品的熒光密度; *表示卷積運算;h1,h2分別為激發(fā)與探測點擴散函數(shù).在MRESCH 系統(tǒng)中,由于雙螺旋相位片的存在,h2由標準PSF變?yōu)镈H-PSF,如圖2(c)所示,其三維強度分布表示為

式中,rot(h,θ)表示將h逆時針旋轉θ角; Δx表示雙螺旋兩個旁瓣之間的距離;k表示DH-PSF 的旋轉角度與樣品離焦距離之間的線性關系;g表示單個旁瓣的強度分布,可近似用高斯函數(shù)進行表示:

圖1 (a) MRESCH 的光路; (b) DH-PSF 在不同軸向位置的強度分布; (c) DH-PSF 旋轉角度與對應軸向位置的關系曲線Fig.1.(a) Optical configuration of MRESCH; (b) intensity distribution of the DH-PSF at different positions along z-axis; (c) relationship between the two lobe rotation angles of the DH-PSF and position of z-axis.

圖2 (a) DMD 上載入的投影模式; (b) 激發(fā)羅丹明染料樣品探測到的熒光點陣分布; (c) 存在相位片的條件下,激發(fā)羅丹明染料樣品探測到的雙螺旋熒光點陣分布Fig.2.(a) Project pattern of DMD; (b) the fluorescence image of the excitation foci in a uniform solution of Rhodamine 6G at the sample plane; (c) the fluorescence image of the excitation foci in a uniform solution of Rhodamine 6G at the sample plane with DH phase mask.

其中,σx,σy分別為高斯函數(shù)在x和y方向的標準差,為了方便計算可將σx,σy看作近似相等.

當MRESCH 進行三維成像時,樣品不同深度發(fā)射的熒光信號會在成像面的不同軸向位置形成多個聚焦點,如圖3 所示.其中,物鏡焦平面上的熒光信號經(jīng)相位片調制后在相機的探測面上形成一個水平的雙螺旋點,而樣品離焦位置的信號則在探測面的對應位置形成具有一定旋轉角度的雙螺旋點.最終,通過計算每個雙螺旋點的旋轉角度來獲得樣品的三維信息.

圖3 MRESCH 的成像原理(FT,傅里葉變換)Fig.3.Imaging principle of MRESCH (FT,Fourier transform).

2.3 MRESCH 的圖像重構過程

在多數(shù)圖像掃描顯微技術中,如ISM,MSIM,MSIMH 等,寬場圖像的重構是將所有掃描位置的熒光點信號進行數(shù)字處理后線性疊加而成.而MRESCH 的圖像重構更加類似于傳統(tǒng)的共聚焦顯微成像,即將每個掃描位置(i,j)的熒光點信號強度作為重構圖像中對應像素位置(i,j)的像素值V(i,j) .由于MRESCH 使用的是面陣探測器sCMOS,需要通過后期數(shù)字處理來實現(xiàn)上述過程.另外,由于雙螺旋相位片的引入將原本高斯分布的激發(fā)熒光點轉換成雙螺旋的形式,其會根據(jù)樣品激發(fā)位置的深度z不同而產(chǎn)生相應的旋轉,如圖4(a)所示.基于上述特性,MRESCH 可以利用數(shù)字針孔(digtal pinhole,DP)將不同深度的樣品熒光信息分別篩選出來進行重構,實現(xiàn)不同樣品層的超分辨二維成像.具體過程見圖4(b),首先,需要將圖像數(shù)據(jù)中所有雙螺旋點附近的灰度值按照掃描的順序依次截取出來構成一個亞圖像堆棧Ri,j(x,y) ;接著,根據(jù)需要重構的樣品層深度z生成一個二值的數(shù)字針孔DP(x,y) ,由兩個圓形二值矩陣構成,兩個圓心的連線與水平方向的夾角為kz.然后,將DP(x,y)依次附在每個雙螺旋點上并對灰度值進行求和,獲得像素值V(i,j) ,用公式表示為

圖4 (a) MRESCH 的原始圖像數(shù)據(jù); (b) 附上數(shù)字針孔后的雙螺旋點; (c) MRESCH 的圖像重構過程Fig.4.(a) Raw images of MRESCH; (b) the pinholed DH-PSF; (c) principle of MRESCH wide-field image reconstruction.

最后,將每個像素值V(i,j) 按照掃描順序進行排列來重構出樣品結構的寬場圖像,如圖4(c)所示.可以看出,當兩個不同角度的DP1和DP2分別應用到同一組MRESCH 數(shù)據(jù)時,同一個掃描位置的像素值V(i,j) 會因為DP的不同而產(chǎn)生明顯的數(shù)值差異,最終重構出兩個完全不同的寬場圖像,它們分別對應不同深度的樣品結構信息.

3 MRESCH 的生物學實驗

為了確定MRESCH 的成像分辨率,使用牛肺動脈內皮細胞標準樣片(F36924,Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)作為測試樣品.在實驗中,首先對細胞中的纖維狀肌動蛋白進行寬場照明成像,其結構分布如圖5(a)所示,受到背景熒光的影響,蛋白微絲束的周圍充斥著大量的噪聲,將一些原本微弱的樣品結構信號淹沒,造成部分細節(jié)的丟失和橫向分辨率的下降.接著,利用MRESCH 對同一區(qū)域進行掃描并重構,結果如圖5(b)所示.可以看出,數(shù)字針孔的使用有效地將微絲束周圍的背景熒光濾除,大幅提高了圖像的對比度.為了更好地比較兩種方法,對圖5(a)和圖5(b)中矩形虛線區(qū)域進行放大,如圖5(c)所示,通過比較發(fā)現(xiàn),MRESCH 能夠將原本在圖5(c)-1 中難以分辨的相鄰微絲束結構區(qū)分開來.最后,通過對圖5(a)和圖5(b)中劃線位置橫切面強度的半高寬進行計算來確定MRESCH 的橫向分辨率,其數(shù)值曲線如圖5(d)所示,其中寬場照明成像的橫向分辨率約為374 nm,MRESCH 約為277 nm,結果表明MRESCH 的橫向分辨率約為寬場照明的1.34 倍,與傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡相近.

接著利用MRESCH 對海拉細胞中的線粒體進行三維成像,該樣品經(jīng)染料標記后,能夠在488 nm的激光照射下發(fā)射高效率的530 nm 綠色熒光信號.在實驗中,首先將樣品固定在三維位移臺上,并對線粒體在不同軸向位置(z= 0,± 1000 nm)的結構分布進行寬場照明成像,結果如圖6(a)—(c)所示,可以看出線粒體在整個細胞中呈三維的結構分布,其在不同的軸向位置具有不同的結構形態(tài).接著將樣品移回至z= 0 nm 的位置并利用MRESCH 對樣品進行二維掃描,掃描點的橫縱間距分別為30 pixels 和26 pixels,掃描步數(shù)為780 步,每步對應的相機曝光時間為8 ms,成像總時間約6 s.最后根據(jù)2.3 節(jié)所述的數(shù)據(jù)處理方法,利用不同角度的數(shù)字針孔對不同深度的樣品信息進行重構,結果如圖6(d)—(f),可以看出重構的線粒體結構相比于寬場照明更加銳利.另外,傳統(tǒng)的寬場照明成像只能夠獲得位于物鏡焦面附近的樣品結構信息,其他軸向位置的線粒體結構在探測面上會變得模糊而無法分辨,如果想要獲得離焦區(qū)域的結構信息,需要將物鏡重新對焦到離焦面或者利用位移臺把樣品沿軸向位置移動一定距離,這些過程都會花費大量的成像時間.對于MRESCH 而言,基于雙螺旋點擴散函數(shù)的特點,可以通過單次掃描和后期數(shù)據(jù)處理來獲得樣品在一定軸向范圍內的三維空間結構,大幅提高數(shù)據(jù)采集效率.

圖5 寬場照明和MRESCH 對纖維狀肌動蛋白的成像結果比較 (a) 纖維狀肌動蛋白的寬場照明成像結果; (b) MRESCH 的成像結果; (c) 圖(a)和圖(b)中白色方塊區(qū)域的放大; (d)圖(a)和圖(b)中劃線位置的橫切面強度圖(半高寬分別為: 寬場(WF)照明圖像374 nm、MRESCH 圖像 277 nm)Fig.5.Comparison of F-actin imaging results with wide-field illumination and MRESCH: (a) Wide-field image of F-actin;(b) MRESCH image of F-actin; (c) magnification of white box region in panels (a) and (b); (d) plots of intensity along the colored lines in panels (a) and (b); the FWHM values are 374 nm and 277 nm for wide-field (WF) and MRESCH,respectively.

圖6 寬場照明和MRESCH 對海拉細胞線粒體成像結果比較 (a) 線粒體在z = –1000 nm 位置的寬場成像結果; (b) 線粒體在z = 0 nm 位置的寬場成像結果; (c) 線粒體在z = 1000 nm 位置的寬場成像結果; (d) 線粒體在z = –1000 nm 位 置 的MRESCH 成像結果; (e) 線粒體在z = 0 nm 位置的MRESCH 成像結果; (f) 線粒體在z = 1000 nm 位置的MRESCH 成像結果Fig.6.Comparison of mitochondrial imaging results of HeLa cells with wide-field illumination and MRESCH: (a) Wide-field image of mitochondria at z = –1000 nm; (b) wide-field image of mitochondrion at z = 0 nm; (c) wide-field image of mitochondria at z =1000 nm; (d) image obtained via MRESCH at z = –1000 nm; (e) image obtained via MRESCH at z = 0 nm; (f) image obtained via MRESCH at z = 1000 nm.

4 總 結

本文基于雙螺旋點擴散函數(shù)工程,提出了一種多焦點圖像掃描顯微技術.該方法將傳統(tǒng)的多焦點結構光照明顯微技術與雙螺旋點擴散函數(shù)工程相結合,通過后期的數(shù)據(jù)處理,能夠從單次二維掃描的信息中重構出不同深度的樣品信息,大幅減少了三維成像所需要的二維掃描次數(shù),提高樣品采集的速度并減少了光毒性,對于生命科學的研究具有重要的意義.