唐一梅,余 雙,陳慶慶,2,秦 蓓,張德柱,王曉茹
(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,藥物研究所,陜西 西安 710021;2.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,四川 成都 610500;3.陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,陜西 西安 710025;4.陜西功能食品工程中心有限公司,陜西 西安 710065)
“石菖蒲-丹參”開竅醒腦,活血化瘀,但目前文獻(xiàn)報(bào)道的“石菖蒲-丹參”組方多為臨床實(shí)踐總結(jié),對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究報(bào)道很少。
鄭曉暉教授課題組研究了使藥冰片[1]、郁金[2]、檀香[3]、丹皮[4]、降香[5]等對(duì)君藥丹參藥代動(dòng)力學(xué)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)使藥對(duì)君藥具有增效作用。于潔等[6]研究石菖蒲和丹參配伍后,石菖蒲對(duì)丹參藥代動(dòng)力學(xué)的影響。結(jié)果表明,石菖蒲和丹參配伍后,可以促進(jìn)丹參在大鼠血液中的吸收程度和速度,增加君藥丹參的生物利用度。
離子液體是一種新型的溶劑[7],具有熱穩(wěn)定性好、蒸氣壓低、溶解能力強(qiáng)、可設(shè)計(jì)性等優(yōu)點(diǎn)[8],已用于有機(jī)合成[9-10]、電化學(xué)[11]、生物工程[12]、萃取分離[13-18]等領(lǐng)域。研究以離子液體為輔助溶劑,丹參素、α-細(xì)辛醚為檢測(cè)指標(biāo),干預(yù)使藥中有效成分的提取量,得到的使藥提取液作為溶劑提取分析君藥有效成分提取量的變化。從分子水平上,闡明君藥與使藥配伍之后的物質(zhì)基礎(chǔ)變化是密切相關(guān)的,兩者作用源于有效成分之間存在的相互作用。
1-甲基-3-丁基-咪唑溴([BMIM]Br),1-甲基-3-辛基咪唑溴離子液體([OMIM]Br):自制;六氟磷酸鉀:化學(xué)純,薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司;丹參素對(duì)照品:純度≥98%,批號(hào)KJ0622CA14,上海源葉生物科技有限公司;α-細(xì)辛醚對(duì)照品:純度≥98%,批號(hào)R27J7Y1678,上海源葉生物科技有限公司;甲醇:色譜純,美國Fisher公司;甲酸:分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;丹參:唇形科植物丹參的干燥根及根莖;石菖蒲:天南星科菖蒲屬石菖蒲的干燥根莖,均經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室汪興軍老師鑒定,分別粉碎,過篩(孔內(nèi)徑:250 μm±9.9 μm),待用。
高效液相色譜儀:G1312B型1260,美國Agilent公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S型,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;超聲波清洗器:SB-5200DT型,寧波新芝生物科技股份有限公司。
1.2.1 供試品溶液的制備
1.2.1.1 丹參提取液的制備
稱取丹參粉末3 g置100 mL圓底燒瓶中,加8倍量的水,浸泡30 min,回流提取2次,每次1.5 h,提取完成后趁熱抽濾,合并濾液;用體積比75%甲醇定容至100 mL,得到提取液樣品;精密移取1.00 mL樣品溶液,用75%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶。
稱取丹參粉末3 g置100 mL圓底燒瓶中,加8倍量的水與2.67 mL[BMIM]Br離子液體浸泡30 min,回流提取2次,每次1.5 h,提取完成后趁熱抽濾,合并濾液;濾液加入2.77 g六氟磷酸鉀(KPF6)于40 ℃水浴60 min除去離子液體,離心取上清液定容至100 mL;精密移取1.00 mL樣品溶液,用75%甲醇定容至10 mL容量瓶。
稱取丹參粉末3 g置100 mL圓底燒瓶中,先加入2.67 mL[BMIM]Br離子液體浸泡30 min,再加入8倍量的水,回流提取2次,每次1.5 h,提取完成后趁熱抽濾,合并濾液;濾液加入2.77 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去離子液體,離心取上清液定容至100 mL;精密移取1.00 mL樣品溶液,用75%甲醇定容至10 mL容量瓶。
1.2.1.2 石菖蒲提取液的制備
稱取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圓底燒瓶中,加入8倍量的水浸泡2 h,回流提取2 h,提取完成后趁熱抽濾,得石菖蒲水提取液;提取液用75%甲醇定容置50 mL,得石菖蒲水體液供試品溶液。
稱取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圓底燒瓶中,加入8倍量的水與0.6 mL[OMIM]Br離子液體浸泡2 h,回流提取2 h,提取完成后趁熱抽濾;濾液加入0.49 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去離子液體,離心取上清液,得石菖蒲離子液體-水提取液;提取液用75%甲醇定容至50 mL的容量瓶,得供試品溶液,得石菖蒲離子液體-水供試品溶液。
稱取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圓底燒瓶中,先加入0.6 mL[OMIM]Br離子液體浸泡2 h,再加入8倍量的水,回流提取2 h,提取完成后趁熱抽濾;濾液加入0.49 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去離子液體,離心取上清液,得石菖蒲離子液體(浸泡2 h后)-水提取液;用75%甲醇定容至50 mL的容量瓶,得石菖蒲離子液體(浸泡2 h后)-水供試品溶液。
1.2.1.3 丹參-石菖蒲提取液的制備
按1.2.1.2方法得到的3種石菖蒲提取液補(bǔ)足至固液質(zhì)量比1∶8,加入到3 g丹參中,回流提取2次,每次1.5 h,提取完成后趁熱抽濾,合并濾液,用75%甲醇定容至100 mL,得到丹參-石菖蒲提取液樣品;精密移取1.00 mL樣品溶液,用75%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶。
1.2.2 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取α-細(xì)辛醚對(duì)照品1.0 mg,丹參素對(duì)照品5.0 mg用75%甲醇定容至25 mL容量瓶中,得到ρ(α-細(xì)辛醚)=0.04 mg·mL、ρ(丹參素)=0.2 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。
1.2.3 色譜條件
Agilent HC-C18(4.6×150 mm,5 μm)色譜柱;HPLC分析條件:流動(dòng)相為甲醇-水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%甲酸)線性梯度洗脫:0~9 min,20∶80;9~12 min,50∶50;12~22 min,70∶30;柱溫:30 ℃;流速:0.8 mL·min-1;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)波長:286 nm。
1.4.4 線性范圍
吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL用75%甲醇至10 mL容量瓶,得到ρ(丹參素)=5、10、15、20、30、40 μg/mL與ρ(α-細(xì)辛醚)=2、4、6、8、12、16 μg·mL的混合對(duì)照品溶液,過0.45 μm微孔濾膜,分別精密吸取10 μL進(jìn)樣,記錄質(zhì)量濃度和峰面積。以峰面積A為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度c為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算,得丹參素線性回歸方程A=6.0984c-31.5(r=0.994 0),α-細(xì)辛醚線性回歸方程A=18.939c-18.05(r=0.999)。結(jié)果表明,丹參素在5~40 μg/mL、ρ(石菖蒲)=2~16 μg/mL線性關(guān)系良好。
根據(jù)《中國藥典》2015版附錄《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》要求,采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中待測(cè)成分的含量,方法學(xué)考察符合測(cè)定要求,結(jié)果見表1。
表1 不同溶劑及提取方式對(duì)有效成分得率的影響
以水、離子液體-水為溶劑提取劑時(shí),獲得丹參、石菖蒲供試品溶液分析結(jié)果,見圖1。
不同溶劑體系
由表1、圖1可知,當(dāng)用水-離子液體混合溶劑提取時(shí),丹參素的得率明顯高于水提取的丹參素的得率,石菖蒲中α-細(xì)辛醚的得率也高于水提取的得率,且離子液體浸泡后加水再浸泡后提取,有效成分得率均高于離子液體-水混合浸泡的得率。
離子液體浸泡后加水提取,應(yīng)分2種情況,(1)離子液體浸泡(超聲)后直接加水提??;(2)離子液體浸泡后加水再浸泡。這2種情況結(jié)果不同,純離子液體浸泡目的在于離子液體能夠溶解纖維素、破除細(xì)胞壁,利于有效成分釋放。當(dāng)離子液體溶解了纖維素、破除細(xì)胞壁后,再繼續(xù)用離子液體-水溶劑浸泡,目的是利于有效成分更好轉(zhuǎn)移到溶劑體系中。因此,在一些文獻(xiàn)中出現(xiàn)離子液體浸泡后,提取獲得有效成分反而低于離子液體-水混合后浸泡有效成分的提取得率[19]。
總之,離子液體的加入,有效成分提取得率提高,這與離子液體的獨(dú)特屬性有關(guān),具有很好的傳質(zhì)作用,破壞了植物的細(xì)胞壁,從而加速藥材中有效成分的溶出[20]。
丹參-石菖蒲混合供試品溶液分析結(jié)果,見圖2。
不同溶劑體系
由表1、圖2可知,丹參素的得率在提取劑為水-石菖蒲(離子液體浸泡后加水)提取液的條件下最高,提取劑為水-石菖蒲(離子液體水混合)提取液得率次之,水-石菖蒲提取液進(jìn)行提取時(shí)得率最低。
相反,當(dāng)水-石菖蒲提取液為提取溶劑時(shí)所得的混合溶液中α-細(xì)辛醚的得率最高。分析其原因可能由于加入離子液體的石菖蒲提取液再對(duì)丹參進(jìn)行提取時(shí)因?yàn)橐綦x子液體時(shí)進(jìn)行的40 ℃水浴時(shí)導(dǎo)致石菖蒲中揮發(fā)性成分有所損失。
丹參不同提取方式,供試品溶液測(cè)試結(jié)果,見圖3。
不同溶劑體系
由圖3可知,當(dāng)提取液中有石菖蒲時(shí),所得的丹參素得率均比沒有石菖蒲有效成分時(shí)的得率要高,分析其原因可能由于石菖蒲中的有效成分與丹參素有弱的相互作用,進(jìn)而導(dǎo)致丹參素的得率增加。由表1可知,α-細(xì)辛醚的量相對(duì)減少,可能是石菖蒲中提取液中其他有效成分增加,這些有效成分與丹參素有著弱的相互作用力,從而導(dǎo)致丹參素得率增加。通過研究,表明單一檢測(cè)α-細(xì)辛醚的量不足以表明君-使藥對(duì)之間的作用機(jī)制。石菖蒲的有效成分主要為揮發(fā)性成分,其中一部分溶于水的小分子可能與丹參素有著弱的相互作用力,從而導(dǎo)致丹參素的得率增加。
總之,離子液體作為一種表面活性劑,本身就有著傳統(tǒng)溶劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn),作為綠色溶劑,離子液體能破除細(xì)胞壁,破壞纖維素使有效成分溶出。
君-使藥對(duì)構(gòu)成的藥對(duì)體系是一個(gè)復(fù)雜的物質(zhì)體系,配伍之后之所以能夠產(chǎn)生協(xié)同作用,從化學(xué)的角度分析,這與藥對(duì)配伍之后在分子水平上的物質(zhì)基礎(chǔ)變化是密切相關(guān)的,其本質(zhì)原因是君藥和使藥在體內(nèi)各自有組效應(yīng)物質(zhì),這2組效應(yīng)物質(zhì)之間協(xié)同作用,加上機(jī)體的調(diào)和作用,從而起到相應(yīng)的療效。
研究充分說明石菖蒲中的揮發(fā)性成分可能與丹參素有著弱的相互作用力,這能夠闡明“君-使”對(duì)藥引經(jīng)、增效實(shí)質(zhì),為研究復(fù)方配伍規(guī)律的體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理,開發(fā)高效創(chuàng)新藥物提供新參考。