陳雪琴 張建龍 萬祥輝 魏小勇

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是國內(nèi)外最常見和預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)最新數(shù)據(jù)顯示，2017年肝癌全球新發(fā)病例95萬，位列第六；死亡病例82萬，位列第四[1]。近年來，肝癌的診治技術(shù)雖得到不斷提升，但肝癌患者的預(yù)后仍然較差，5年生存率甚至低于10%[2]。研究表明，肝癌的預(yù)后與腫瘤大小、數(shù)量、細(xì)胞分化程度、血管侵犯及炎癥程度顯著相關(guān)[3]，但即便沒有這些重要因素的影響，肝癌的死亡率仍不盡人意。因此，尋找新的預(yù)測(cè)標(biāo)記物對(duì)改善肝癌患者預(yù)后具有十分重要的意義。

白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)家族是由IL-1A、IL-AB及IL-1RA組成的重要炎性細(xì)胞因子。研究表明，IL-1通過調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)與惡性腫瘤細(xì)胞的相互作用模式，在腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵犯及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一類具有RNA沉默和轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)功能的短鏈非編碼RNA分子，它通過結(jié)合目的mRNA的3'UTR區(qū)發(fā)揮調(diào)控功能[6]。以往的研究表明，位于3'UTR區(qū)的遺傳多態(tài)通過破壞miRNA與mRNA的結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)[7]。大量的流行病學(xué)研究顯示，位于IL-1A基因3'UTR區(qū)的遺傳變異位點(diǎn)rs3783553與宮頸癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌及肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[8-9]。我們以往的研究也表明rs3783553與慢性乙肝病毒感染風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)，但目前對(duì)它在肝癌預(yù)后中的作用研究較少?；趓s3783553在慢性乙肝病毒感染及肝癌中的重要作用，我們通過隊(duì)列研究的方法對(duì)rs3783553與肝癌預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2011年9月至2014年5月期間，我們嚴(yán)格按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，選擇了510例在江西省腫瘤醫(yī)院確診的原發(fā)性肝癌患者作為研究對(duì)象。納入的研究對(duì)象均是首次確診的HCC患者，無惡性腫瘤病史且未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。研究對(duì)象的人口學(xué)資料由經(jīng)培訓(xùn)的研究員調(diào)查獲得，臨床資料來源于醫(yī)院電子病歷，隨訪資料由專門的隨訪員進(jìn)行調(diào)查記錄?；颊叱鲈汉竺?個(gè)月進(jìn)行一次隨訪。我們的研究在取得江西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行。在研究對(duì)象知情同意后，對(duì)每位患者抽取1ml外周血用于基因分型。

1.2 基因型分析

首先采用百泰克凝固血基因組DNA小量提取試劑盒經(jīng)過一系列步驟提取血樣中的DNA。利用低通量基因分型方法TaqMan對(duì)所有樣本進(jìn)行分型。引物探針合成后，按照說明配置PCR反應(yīng)體系，并將其加至384孔板中，每一個(gè)384孔板均設(shè)置4個(gè)陰性對(duì)照。采用ABI公司的9700高速基因擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，嚴(yán)格控制PCR的反應(yīng)條件，隨機(jī)抽取6個(gè)孔的樣本進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)PCR的質(zhì)量。在7900HT熒光定量PCR儀上進(jìn)行基因分型，采用SDS2.4軟件讀取分型后的數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

患者的死亡時(shí)間定義為首次治療時(shí)間至死亡時(shí)間或最后一次隨訪時(shí)間。采用顯性、隱性及加性三種遺傳模型對(duì)遺傳變異位點(diǎn)的作用進(jìn)行分析。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)用來估計(jì)和比較不同基因型的生存曲線，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸校正年齡、性別、吸煙情況及TNM分期的混雜影響，計(jì)算遺傳變異位點(diǎn)rs3783553的校正HR (hazard ratios，HR)值及95%可信區(qū)間(confidence internal，CI)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0軟件包進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究人群的基本情況與預(yù)后分析

本研究共納入510例原發(fā)性肝癌患者，其人口學(xué)特征及臨床資料如表1所示。研究對(duì)象的年齡中位數(shù)為52歲，男性患者占86.27%，吸煙患者占43.5%。本研究的中位隨訪時(shí)間為35.5個(gè)月，共有289例患者在隨訪期間因肝癌死亡，死亡率為56.7%。單因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示：年齡(HR=1.32，95%CI=1.04～1.66)和腫瘤分期(HR=5.38，95%CI=4.18～6.94)與肝癌患者死亡風(fēng)險(xiǎn)存在顯著相關(guān)性。

表1 研究人群的基本特征與預(yù)后分析(例，%)

2.2 基因分型結(jié)果及生存曲線分析

基因分型結(jié)果顯示，在研究對(duì)象中存在缺失/缺失(Del/Del)、缺失/插入(Del/Ins)和插入/插入(Ins/Ins)三種基因型分布。510例研究對(duì)象中共有492例分型成功。不同基因型患者的生存情況如圖1所示。Del/Del基因型HCC患者中位生存期為41.1個(gè)月，Del/Ins+Ins/Ins基因型HCC患者中位生存期為43.8個(gè)月。Log-rank檢驗(yàn)比較兩者的生存曲線顯示，攜帶Del/Del基因型患者生存率與Del/Ins+Ins/Ins基因型患者的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.994)。

圖1 rs3783553不同基因型肝癌患者生存曲線

2.3 遺傳變異位點(diǎn)rs3783553與肝癌死亡風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性分析

遺傳變異位點(diǎn)rs3783553在HCC人群中的分布及其與HCC死亡風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系分析如表2所示。在多因素Cox回歸模型中經(jīng)過對(duì)年齡、性別、吸煙情況及腫瘤分期進(jìn)行校正后，尚未發(fā)現(xiàn)rs3783553不同基因型患者與肝癌死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(顯性模型：HR=0.92，95%CI=0.71～1.19；加性模型：HR=0.91，95%CI=0.76～1.11)。我們進(jìn)一步對(duì)年齡、性別、吸煙及腫瘤分期情況進(jìn)行分層分析，在顯性模型中運(yùn)用Cox回歸模型對(duì)其他因素校正后，未發(fā)現(xiàn)rs3783553與肝癌死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(表3)。

表2 rs3783553基因型頻率分布及其與HCC死亡風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

表3 顯性模型中rs3783553與HCC死亡風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)分層分析

3 討論

MicroRNA-122是肝臟中最豐富的miRNA，約占所有miRNA種群的70%[10]。越來越多的證據(jù)表明microRNA-122在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，血清中microRNA-122的表達(dá)水平與肝癌的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[11]。體外的研究表明，microRNA-122可作為腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)移[12]，肝癌組織中microRNA-122表達(dá)的缺失可增強(qiáng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移屬性[13]。MiRNA的作用形式主要是通過與mRNA結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA水平與蛋白質(zhì)的表達(dá)，而這種結(jié)合可被位于miRNA結(jié)合位點(diǎn)上的遺傳多態(tài)所影響。本文主要探討的是位于microRNA-122結(jié)合位點(diǎn)上的遺傳多態(tài)在肝癌預(yù)后中的作用。

2009年，研究者們發(fā)現(xiàn)位于IL-1A 3'UTR區(qū)功能性多態(tài)位點(diǎn)rs3783553可通過改變與microRNA-122與miRNA378結(jié)合，影響IL-1A的表達(dá)。Gao等的研究表明rs3783553插入(TTCA)基因型可顯著降低原發(fā)性肝癌的易感風(fēng)險(xiǎn)，TTCA基因型的缺失可增強(qiáng)IL-1A與microRNA-122與microRNA-378的結(jié)合，抑制IL-1A的表達(dá)，削弱了IL-1A在腫瘤發(fā)展中的免疫調(diào)節(jié)作用[14]。隨后的研究也發(fā)現(xiàn)攜帶rs3783553插入(TTCA)等位基因的人群患鼻咽癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌及結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低[15]，且缺失等位基因型癌細(xì)胞的惡性程度顯著升高。同時(shí)，在我們此前的研究中也顯示遺傳變異位點(diǎn)rs3783553與慢性乙肝病毒感染風(fēng)險(xiǎn)存在顯著關(guān)聯(lián)。因此，IL-1A rs3783553可能作為肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的遺傳標(biāo)記物。基于此種假設(shè)，我們運(yùn)用隊(duì)列研究的方法對(duì)rs3783553與肝癌預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行了探討，尚未發(fā)現(xiàn)rs3783553不同基因型患者與肝癌死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

我們的研究首次從miRNA的角度出發(fā)，探討了位于microRNA-122靶基因IL-1A 3'UTR區(qū)功能性多態(tài)位點(diǎn)rs3783553與肝癌預(yù)后之間的關(guān)系。研究表明，雖然rs3783553與慢性乙肝病毒感染與肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，但不是肝癌死亡風(fēng)險(xiǎn)的影響因素。本研究是一項(xiàng)前瞻性的隊(duì)列研究，受樣本量和隨訪時(shí)間的影響研究結(jié)果具有一定的局限性，仍需更大樣本量的研究進(jìn)行進(jìn)一步論證。