梁運特 黃仲海 廖志遠 張琴 湯勇 孫平良

摘 要 目的：研究安腸湯對2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）致潰瘍性結腸炎（UC）模型大鼠Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信號通路及糞鈣衛(wèi)蛋白（FC）表達的影響。方法：將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組[雙歧桿菌活菌膠囊，5 mL（含雙歧桿菌活菌0.35 g）]和安腸湯低、中、高劑量組（1、5、10 mL，每mL約相當于生藥總量0.11 g），每組15只。除空白組大鼠注入生理鹽水外，其余各組大鼠均采用TNBS結合乙醇復合灌腸法建立UC模型。造模成功2 d后，空白組、模型組大鼠灌胃生理鹽水5 mL，各藥物組大鼠灌胃相應藥物，每日1次，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后，采用蘇木精-尹紅染色法觀察大鼠結腸組織的病理改變;采用Western blotting法檢測大鼠結腸組織中TLR4、TNF受體關聯(lián)因子6（TRAF6）、NF-κB蛋白的表達水平;采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA的表達水平;采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6以及糞便樣品中FC的水平。結果：與空白組比較，模型組大鼠的結腸黏膜嚴重受損，其結腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白和TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κb mRNA的表達水平以及血清TNF-α、IL-6及糞便樣品中FC水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，各藥物組大鼠結腸組織病變均有不同程度的改善，且上述指標水平均顯著降低（P<0.05）。結論：安腸湯可能通過調節(jié)TLR4/NF-κB信號通路及FC水平來減輕UC模型大鼠的炎癥反應。

關鍵詞 潰瘍性結腸炎;安腸湯;Toll樣受體4;TNF受體關聯(lián)因子6;核因子κB;糞鈣衛(wèi)蛋白

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）02-0189-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.11

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of Anchang decoction on TLR4/NF-κB signaling pathway and the expression of fecal calprotectin （FC） in TNBS-induced ulcerative colitis （UC） model rats. METHODS： SD rats were randomly divided into blank group， model group， positive control group [Live Bifidobacterium capsules，5 mL （containing Bifidobacterium 0.35 g）]， Anchang decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups （1，5，10 mL， each milliliter is approximately equivalent to 0.11 g of total crude drug）， with 15 rats in each group. Other groups were given TNBS combined with ethanol enema to establish UC model rat， except blank group was given normal saline. Two days after successful modeling， blank group and model group were given normal saline 5 mL， administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 14 d. After last medication， HE staining was used to observe the pathological change of colon tissue in rats. Western blotting assay was used to detect the protein expression of TLR4， TRAF6 and NF-κB in colon tissues of rats; Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect mRNA expression of TLR4， TRAF6， TNF-α and NF-κB; ELISA assay was adopted to detect serum level of TNF-α， IL-6 and FC in stool samples. RESULTS： Compared with blank group， the colonic mucosa of model group was severely damaged， and the protein expression of TLR4， TRAF6 and NF-κB， mRNA expression of TLR4， TRAF6， TNF-α and NF-κb as well as serum levels of TNF-α， IL-6 and FC level in stool samples were increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the pathological changes of colon tissue in rats were improved in different administration groups to different extents， and above indexes were all decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Anchang decoction may relieve the inflammation of UC model rats by regulating the TLR4/NF-κB signaling pathway and the expression of FC.

KEYWORDS? ?Ulcerative colitis; Anchang decoction; TLR4; TRAF6; NF-κB; Fecal calprotectin

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）以反復腹瀉、排膿血便、身體消瘦、發(fā)熱等炎癥癥狀為主要臨床表現(xiàn)，其病情反復、難以治愈，逐漸成為近年來研究的熱點[1]。Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信號通路被認為是促進炎癥因子釋放的重要途徑，當該通路被激活時，促炎因子[如腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1（IL-1）等]得以表達，并參與機體炎癥反應、免疫應答等過程[2-3]。李姿慧等[4]研究證實，參苓白術散能夠抑制UC模型大鼠NF-κB相關蛋白的表達，下調血清TNF-α、IL-6及IL-1β的表達水平，從而對大鼠的結腸黏膜起到保護作用，說明NF-κB信號通路與UC的炎癥反應密切相關。

安腸湯是廣西中醫(yī)藥大學肖振球教授治療UC的經驗方。肖教授認為，UC屬中醫(yī)“痢疾”范疇，該病易反復發(fā)作，遷延日久，致脾腎陽虛為主，濕毒瘀邪停滯胃腸為標，強調正虛邪戀為根本，因此創(chuàng)立安腸湯扶正祛邪[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，安腸湯能顯著改善UC模型大鼠的疾病狀態(tài)，減弱其巨噬細胞吞噬能力，改善大鼠腸道微生態(tài)，降低血清內毒素;同時還發(fā)現(xiàn)，糞鈣衛(wèi)蛋白（FC）在UC模型大鼠急性炎癥期表達量上升，可用于評價腸道的炎癥反應情況[6]。那么其作用的機制是否與TLR4/NF-κB信號通路相關，目前尚無相關報道。為此，本研究以UC模型大鼠為研究對象，擬通過探究安腸湯干預對模型大鼠結腸組織中TLR4、TNF受體關聯(lián)因子6（TRAF6）、TNF-α、NF-κB mRNA以及相關蛋白表達水平的影響，闡明該方通過調控TLR4/NF-κB信號通路及FC水平以達到防治UC的藥效作用機制，為其臨床應用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

本文所用的儀器有：T18型組織勻漿機（德國IKA公司）、TU-100C型恒溫金屬浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）、單道移液器和5418R型低溫離心機（德國Eppendorf公司）、一次性使用真空采血管（江西精致科技有限公司）、配套蛋白轉印模塊（濕轉）及PowerPac Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）、TD4型普通離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、DW-86L728J型醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）、FC-1100型超微量核酸檢測儀（青島愛普科生物工程有限公司）、G8830-64001型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Agilent公司）、50I型生物顯微鏡（日本Nikon公司）、Tanon-5200型凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、HED-SY96S型酶標儀（山東霍爾德電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

安腸湯方藥的組成為補骨脂25 g、黃芪20 g、黨參15 g、白頭翁15 g、茯苓15 g、檳榔15 g、熟附子15 g、地榆15 g、赤芍15 g、雞內金10 g、薏苡仁10 g、干姜10 g、白術10 g、木香10 g、延胡索10 g、甘草10 g，用2 000 mL水煎，分2次口服，每日1劑。安腸湯原藥材依據(jù) 2015 年版《中國藥典》（一部）[7]進行炮制，并由廣西中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥劑科加工制備（原藥材全部購自廣東康美藥業(yè)股份有限公司，經廣西中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥學部陳超副主任藥師鑒定為真品）。雙歧桿菌活菌膠囊[陽性對照藥，國藥準字S10960040，批號C13201000927，規(guī)格0.35 g（含0.5億活菌）]購自麗珠集團麗珠制藥廠。本實驗用藥處方及用量全部經過廣西中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥學部審核。

水合氯醛溶液（批號2013101801）、甲醛（批號20130817）均購自成都市科龍化工試劑廠;Takara反轉錄試劑（批號AI80462A）購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司;Triquick Reagent總RNA提取試劑（批號20200212）、高效RIPA組織/細胞裂解液（批號69067530）、蛋白酶抑制劑混合液（100×PIC）（批號P6730）、脫脂奶粉（批號EZ5619C137）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（TBST，批號70015639）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號PC0020）均購自北京索萊寶科技有限公司;5%2，4，6-三硝基苯磺酸溶液（TNBS，批號2508-19-2）購自南寧市托普邦生物科技有限公司;Trans Script?-Uni一步gDNA拆卸和cDNA合成超混合液（批號N20909）購自北京全式金生物科技有限公司;兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號AB-P-R001）購自南寧市托普邦生物科技有限公司;大鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號SLBP0889V）、完全弗式佐劑（批號20170301）均購自上海希格瑪高技術有限公司;超敏型化學發(fā)光（ECL）試劑（批號BL523A）購自合肥蘭杰柯科技有限公司;0.9%氯化鈉注射液（批號H20033974，規(guī)格500 mL;作生理鹽水用）購自貴州科倫藥業(yè)有限公司;小鼠抗大鼠TLR4一抗（批號J1016）購自美國Santa Cruz公司;兔抗大鼠NF-κB p65一抗（批號8242S）購自美國CST公司;兔抗小鼠TRAF6 一抗（批號ab40675）購自美國Abcam公司;大鼠IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）分析試劑盒（批號JYM0651Ra）、大鼠FC ELISA分析試劑盒（批號JYM1159Ra）均購自武漢基因美生物科技有限公司;大鼠TNF-α ELISA分析試劑盒（批號E-EL-R2856c）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，辣根過氧化酶標記的兔二抗（批號7074、7076）購自美國Cell Signaling Technology公司;其余試劑均為實驗室常用規(guī)格。

1.3 動物

健康SPF級SD成年大鼠90只，2月齡，雄雌各半，體質量（250±20）g，購自長沙天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號的SCXK（湘）2014-0011。動物由廣西中醫(yī)藥大學醫(yī)學分子實驗室進行專人飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為安靜、通風、清潔、晝夜室溫20～23 ℃、相對濕度50%～60%。本實驗方案經廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準，批準號為2013（KF）-E- 003。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將其隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和安腸湯低、中、高劑量組，每組15只。參照文獻方法（TNBS結合乙醇復合灌腸法）[8]建立UC大鼠模型：所有大鼠禁食不禁水24 h后，均腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.003 mL/g）進行麻醉，順著大鼠肛門-直腸生理彎曲插入軟管約7 cm，注入TNBS/乙醇（TNBS+等體積50%乙醇，100 mg/kg，以TNBS計）造模，再將大鼠倒立保持2 min以保證藥液充分吸收。造模成功標準[8]：（1）大鼠反復大便溏泄甚至帶有膿血;（2）大鼠食欲及體質量均下降;（3）大鼠精神萎靡、毛色枯槁、畏寒弓背，群體聚堆;具備兩項及以上者認定為造模成功?？瞻捉M大鼠除注入生理鹽水外，其余操作同前。大鼠麻醉清醒后，可自由進飲進食。

造模成功2 d后，空白組和模型組大鼠灌胃生理鹽水5 mL，陽性對照組大鼠灌胃雙歧桿菌活菌膠囊懸液5 mL（以0.9%氯化鈉注射液為溶劑，含雙歧桿菌活菌0.35 g），安腸湯組大鼠按比例灌胃低、中、高劑量安腸湯溶液1、5、10 mL，每mL約相當于生藥總量0.11 g（各藥物組用藥劑量均參照前期試驗[1]并按人與動物體質量系數(shù)換算而得），每日1次，連續(xù)給藥14 d。

2.2 標本采集與處理

末次給藥后，所有大鼠均禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液進行麻醉后，立即剖腹取腹主動脈血約8 mL，靜置30 min，以3 000 r/min離心15 min分離上層血清，置于-20 ℃冰箱內保存，待測。統(tǒng)一在距大鼠肛門約7 cm處取結腸組織后并置于4%多聚甲醛溶液中密封，置于4 ℃下避光保存，待測。取腸道內糞便樣品適量，置于-20 ℃冰箱中保持，待測。

2.3 指標檢測

2.3.1 大鼠結腸組織病理情況觀察 取“2.2”項下經4%多聚甲醛溶液固定后的大鼠結腸組織適量，依次進行石蠟包埋、切片（厚度10 μm）、脫蠟、蘇木精染液染色、沖洗、分化液分化、伊紅染液染色、脫水透明封片等處理，在顯微鏡下觀測組織形態(tài)學改變并拍照。

2.3.2 各組大鼠結腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白表達水平檢測 采用Western blotting法。取“2.2”項下各組大鼠結腸組織40 mg，放入2 mL離心管，按照RIPA裂解液說明書方法提取相關蛋白，勻漿至無沉淀，以12 000 r/min離心5 min，取上清液采用BCA法測定蛋白含量并定量至2 μg/μL。蛋白于100 ℃變性10 min，取變性后的蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用8%脫脂奶粉室溫封閉3 h。加入相應一抗[TLR4（稀釋度為1 ∶ 2 000）、TRAF6（稀釋度為1 ∶ 2 000）、NF-κB（稀釋度為1 ∶ 2 000）、GAPDH（稀釋度為1 ∶ 2 000）]，37 ℃孵育12 h;以TBST洗膜15 min×3次，加入IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 4 000），37 ℃ 孵育1 h，以TBST洗膜15 min×3次。以ECL顯色后，于凝膠成像儀中進行曝光成像后，采用Image J 1.51軟件對蛋白條帶灰度值進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.3.3 各組大鼠結腸組織中TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA水平檢測 采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法。取“2.2”項下各組大鼠結腸組織適量，剪碎后放入2 mL離心管，加入 Triquick Reagent總RNA提取試劑1 mL，勻漿至無沉淀，靜置5 min后加入氯仿0.2 mL，振蕩15 s;于4 ℃下以4 500 r/min離心15 min后，取上清液0.5 mL加至另一1.5 mL離心管中;加入異丙醇0.5 mL，置于室溫下靜置10 min;重復上述步驟3次，棄上清液。沉淀于65 ℃金屬浴鍋中烘干，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水0.03 mL溶解，經超微量核酸檢測儀測定RNA濃度并按反轉錄試劑盒說明書進行操作，將所得cDNA置于-80 ℃冰箱內保存，待用。RT-PCR反應體系為MonAmpTM SYBR? Green qPCR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，正向引物（10 μmol/L）0.4 μL，反向引物（10 μmol/L）0.4 μL，H2O 8.2 μL;反應條件為95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt法計算各目標基因mRNA的表達水平（式中Ct表示熒光信號強度達到設定閾值時經歷的循環(huán)次數(shù)）。引物序列詳見表1。

2.3.4 各組大鼠血清中相關炎癥因子以及糞便樣品中FC水平檢測 采用ELISA法。取“2.2”項下血清/糞便樣品適量，參照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-6以及糞便樣品中FC的水平。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠結腸組織的病理改變

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織黏膜表面嚴重缺損，可見深達肌層的潰瘍壞死。經藥物治療后，安腸湯低劑量組大鼠結腸組織黏膜表面較模型組稍有改善，但仍可見炎癥細胞浸潤;而安腸湯中、高劑量組以及陽性對照組大鼠結腸組織恢復明顯，其黏膜表面可見新生腺體且排列較整齊。詳見圖1。

3.2 各組大鼠結腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白表達水平

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，各藥物組大鼠結腸組織中上述指標的表達水平均顯著降低（P<0.05），詳見表2、圖2。

3.3 各組大鼠結腸組織中TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA表達水平

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA表達水平均顯著升高（P<0. 05）;與模型組比較，各藥物組大鼠結腸組織中上述指標的表達水平均顯著降低（P<0. 05），詳見表3。

3.4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6及糞便樣品中FC的水平

與空白組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6及糞便樣品中FC水平均顯著升高（P<0. 05）;與模型組比較，各藥物組大鼠血清/糞便中上述指標水平均顯著降低（P<0.05），詳見表4。

4 討論

目前，UC的病因和發(fā)病機制仍未明確，但近年的研究熱點聚焦在免疫炎癥反應的相關通路上，如NF-κB信號通路、TLR信號通路等分泌的炎癥因子，被證實與UC的炎癥程度密切相關[9-11]。NF-κB是一種蛋白質復合物，在靜息狀態(tài)下因NF-κB/Rel蛋白二聚體與抑制蛋白IκB結合而處于失活狀態(tài)[12];而TLR4屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白受體，在細胞表面能夠識別病原相關分子，在活化信號轉導中起到橋梁作用[13-14]。當TLR4/NF-κB信號通路被異己抗原激活后，其細胞表面受體會發(fā)生構象改變，激活激酶1和代謝性炎癥的IκK復合物使其磷酸化，并由泛素連接酶引導，從而可被泛素化和被溶酶體識別并降解，于是NF-κB從NF-κB抑制因子α（IκBα）重組蛋白復合物中脫離出來，暴露出核定位域，且迅速發(fā)生核轉位，通過與EB病毒靶基因反應元件結合，啟動了相關炎癥因子（如TNF-α、脂多糖、IL-1、過氧化氫等）的表達[15];而產生的炎癥因子又進一步激活NF-κB，從而形成惡性循環(huán)，使病情不斷惡化。牛亞蒙等[16]在研究內毒素性肝損傷時發(fā)現(xiàn)，解毒化瘀通腑方可抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的釋放，減輕內毒素引起的肝損害。段紫鈺等[17]基于TLR4/髓樣分化因子（MyD88）/NF-κB通路的研究發(fā)現(xiàn)，雙草油對大鼠放射性皮炎能起到一定的保護作用。董小鵬等[18]研究表明，血必凈注射液能降低TLR4、NF-κB、TNF-α蛋白的表達水平，從而抑制肺組織炎癥反應。由此可見，TLR4/NF-κB信號通路通過調控炎癥因子的表達在疾病發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。

TNF受體相關因子TRAFs家族成員包括TRAF1～7，其是一類能直接或間接與多種TNF和IL-1/TLRs結合的接頭蛋白，介導多種下游信號通路的信號傳導，從而影響細胞的生長、增殖、分化和死亡[19-20];此外，TRAF2～7的N-末端存在一個環(huán)指結構域，可作為E3泛素連接酶將泛素轉移到目的蛋白上[21]。Deng等[22]研究表明，TRAF6可與E3以及泛素連接酶Ubc13/Uev1A結合形成多聚泛素鏈，使IκB發(fā)生磷酸化，從而激活NF-κB信號通路。陳華群等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在NF-κB信號通路激活過程中，TRAF6發(fā)生降解，且該降解是由蛋白酶復合體介導的，提示TRAF6可能是通過自身的泛素化及蛋白酶降解來調節(jié)NF-κB信號通路的。吳曉丹[24]研究認為，高糖條件下能激活高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/TLR4/TRAF6/NF-κB信號通路，引起細胞自噬從而造成心肌細胞的損傷。Ahmedy等[25]研究認為，蜂毒肽可通過TLR4/TRAF6介導的NF-κB和應激激活的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）途徑來減輕乙酸誘發(fā)的小鼠UC。Yang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過TLR4/TRAF6/ NF-κB信號通路而減輕腦出血引起的神經炎癥。

1980年，Dale等[27]首次從中性粒細胞中分離出FC，是一種新型的炎癥標志物。林麗琳等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在急性炎癥患者體內FC表達水平增高，且比其他炎癥標志物[如C-反應蛋白（CRP）]更加穩(wěn)定。邢曄陳等[29]通過檢測克羅恩患者和健康體檢者的糞便樣本，發(fā)現(xiàn)克羅恩病患者的致病菌和FC的檢出率與豐度都顯著升高。

本研究病理研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結腸組織黏膜表面嚴重缺損，可見深達肌層的潰瘍壞死。經藥物治療后，安腸湯低劑量組黏膜表面較模型組稍有改善，但仍可見炎癥細胞浸潤;而安腸湯中、高劑量組以及陽性對照組大鼠恢復明顯，黏膜表面可見新生腺體且排列較整齊。本研究還發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠結腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白表達水平，TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA水平以及血清中TNF-α、IL-6和糞便樣品中FC水平均顯著升高;而經藥物處理后，各藥物組大鼠上述指標均較模型組顯著降低（P<0.05），尤以安腸湯中、高劑量組及陽性對照組的結果變化明顯。這提示經安腸湯和雙歧桿菌活菌膠囊治療后，UC模型大鼠的炎癥反應得到改善。同時，本研究中以雙歧桿菌活菌膠囊作為陽性對照，以排除使用安腸湯干預后可能出現(xiàn)的假陰性情況，結果表明，兩藥都能抑制TLR4/NF-κB信號通路及FC的表達。

綜上所述，安腸湯可緩解UC模型大鼠的炎癥發(fā)炎，促進腸道組織黏膜的修復，其作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路及FC的表達有關;但因實驗條件有限，筆者尚未深入探討安腸湯與TLR4/NF-κB信號通路的具體藥效機制，有待后續(xù)研究加以完善。

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（收稿日期：2020-07-06 修回日期：2020-12-17）

（編輯：羅 瑞）