張 超，張國(guó)珍，馬 凱

(蘭州交通大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，蘭州 730070)

西北干旱地區(qū)村鎮(zhèn)生活污水水質(zhì)單一，經(jīng)適當(dāng)處理后可就近用于村鎮(zhèn)周邊農(nóng)作物灌溉，從而有效解決當(dāng)?shù)厮Y源短缺和水環(huán)境污染問題[1-2].

ABR處理污水費(fèi)用低、污泥產(chǎn)率低，但其啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)、出水COD較高，出水難以長(zhǎng)期穩(wěn)定地滿足農(nóng)作物灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[3-5].研究表明，在ABR中添加彈性填料可以縮短其啟動(dòng)時(shí)間[6]，提高其對(duì)COD去除效果的穩(wěn)定性[7]，強(qiáng)化其抗低溫和抗負(fù)荷能力[8-9]，且對(duì)氮磷去除率影響很小[10].但這些研究都是關(guān)于添加彈性填料對(duì)ABR去除COD的整體強(qiáng)化效果，而關(guān)于添加彈性填料對(duì)ABR各隔室中COD的去除效果及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響研究卻未見報(bào)道.

目前通過高通量測(cè)序技術(shù)研究污染物去除與微生物群落結(jié)構(gòu)組成及豐度變化的關(guān)系的報(bào)道較多[11-12]，且該技術(shù)在ABR中的研究也有所涉及.陳重軍等[13]研究了厭氧氨氧化型ABR中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ABR中變形菌門豐度最高，且沿程增加，而浮霉菌門沿程降低.Shen等[14]研究了ABR-MBBR系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)副球菌、硫桿菌和巴氏桿菌是系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌.ABR中污染物的去除主要通過細(xì)菌的作用實(shí)現(xiàn)，故本文為研究添加彈性填料對(duì)ABR各隔室中COD的去除效果及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，擬采用兩組ABR進(jìn)行對(duì)比，通過高通量測(cè)序技術(shù)研究添加彈性填料對(duì)ABR中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為有效解決西北干旱地區(qū)水資源短缺和水環(huán)境污染問題提供技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

兩組ABR結(jié)構(gòu)和尺寸完全一致，由四個(gè)隔室組成，長(zhǎng)751 mm，寬180 mm，高500 mm，體積49.6 L.其中一組ABR的上部添加彈性填料，系統(tǒng)構(gòu)造圖如圖1所示.

1.2 實(shí)驗(yàn)用水和方法

實(shí)驗(yàn)用水為校園家屬區(qū)生活污水，COD濃度100.84～310.03 mg/L，氨氮濃度22.56～39.95 mg/L，總氮濃度24.91～45.37 mg/L，總磷濃度2.45～4.75 mg/L.兩組ABR都在常溫下運(yùn)行，水力停留時(shí)間都為1 d，待兩組ABR運(yùn)行穩(wěn)定后(已運(yùn)行近10個(gè)月，對(duì)COD的去除效果已穩(wěn)定1個(gè)月)，分別同時(shí)從兩組ABR各隔室中取水樣測(cè)定(每隔6 d取1次，共取5次).

1.3 分析項(xiàng)目與測(cè)定方法

COD：重鉻酸鉀法.

1.4 高通量測(cè)序分析方法

1.4.1 樣本采集

待兩組ABR運(yùn)行穩(wěn)定后，分別同時(shí)從兩組ABR各隔室中取少量污泥，并從有彈性填料ABR中取彈性填料上少量的泥膜于10 mL離心管中.有彈性填料ABR第1～4隔室中的樣本(污泥和泥膜的混合物)分別命名為A(A1、A2和A3)、B(B1、B2和B3)、C(C1、C2和C3)、D(D1、D2和D3)，無彈性填料ABR第1～4隔室中的樣本(污泥)分別命名為E(E1、E2和E3)、F(F1、F2和F3)、G(G1、G2和G3)和H(H1、H2和H3)，所有樣本先經(jīng)-4 ℃冰箱冷凍，再包裹保溫材料寄往檢測(cè)公司.

1.4.2 DNA提取與檢測(cè)

用Water DNA Isolation Kit試劑盒進(jìn)行提取.

1.4.3 PCR擴(kuò)增

用通用引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物名稱和序列為：上游(338F和ACTCCTACGGGAGGCAGCA)，下游(806R和GGACTACHVGGGTWTCTAAT).

1.4.4 PCR產(chǎn)物定量、混樣

用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit進(jìn)行定量，按樣本所需的數(shù)據(jù)量進(jìn)行混樣.

1.4.5 文庫(kù)構(gòu)建

用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit進(jìn)行建庫(kù).

1.4.6 文庫(kù)質(zhì)檢與定量

取1 uL文庫(kù)，用Agilent High Sensitivity DNA Kit做2100質(zhì)檢，用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit進(jìn)行定量.

1.4.7 測(cè)序

測(cè)序區(qū)域?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)細(xì)菌16S V3-V4區(qū)，目的片段長(zhǎng)度為480 bp，測(cè)序策略為NovaSeq-PE250.

1.5 數(shù)據(jù)分析、處理和統(tǒng)計(jì)方法

每個(gè)水樣的COD測(cè)兩組平行樣，用Origin軟件作圖.每個(gè)泥樣測(cè)三組平行樣，OUT數(shù)目和各分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐度先取平均值，再用QIIME2軟件作圖，Alpha多樣性指數(shù)直接作圖.

通過細(xì)菌群落花瓣圖分析，了解不同樣本之間共有與特有物種數(shù)目的差異.通過Alpha多樣性指數(shù)分析，了解某一樣本中細(xì)菌群落的豐富度、多樣性和均勻度.通過門(屬)分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，了解不同樣本之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在種類和相對(duì)豐度上的差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 COD的去除效果

兩組ABR各隔室中平均COD去除率如圖2所示.由圖2可以看出，兩組ABR第1隔室中的平均COD去除率最高，這主要是因?yàn)榱魅氲?隔室中的污水COD最高，故第1隔室中的厭氧微生物可以優(yōu)先利用進(jìn)水中易于降解的COD.

與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR第1隔室中的平均COD去除率較高，這主要是因?yàn)閺椥蕴盍峡梢暂^好地截留污水中的SS，且彈性填料上附著生長(zhǎng)了一定量的微生物，使有彈性填料ABR第1隔室中的生物量有所增加.但有彈性填料ABR第2、3隔室中的平均COD去除率卻低于無彈性填料ABR，這主要是因?yàn)檫M(jìn)入無彈性填料ABR第2、3隔室中污水的COD較高.兩組ABR第4隔室中的平均COD去除率相差不大，這主要是因?yàn)檫M(jìn)入兩組ABR第4隔室中污水的COD都很低.

圖2 兩組ABR各隔室中平均COD去除率Fig.2 The average removal rate of COD in each compartment of ABR in two groups

2.2 細(xì)菌群落花瓣圖分析

兩組ABR各隔室中細(xì)菌群落花瓣圖如圖3所示.由圖3可以看出，兩組ABR都是第1隔室中特有的OTU數(shù)目最多，且無彈性填料ABR各隔室中特有的OTU數(shù)目沿著水流方向逐漸減少，而有彈性填料ABR各隔室中特有的OTU數(shù)目雖然沿著水流方向上下波動(dòng)，但總的趨勢(shì)是減少的，表明兩組ABR都是第1隔室中特有的細(xì)菌群落最多，且無彈性填料ABR各隔室中特有的細(xì)菌群落沿著水流方向逐漸減少，而有彈性填料ABR各隔室中特有的細(xì)菌群落雖然沿著水流方向上下波動(dòng)，但總的趨勢(shì)是減少的.這說明兩組ABR前面隔室中較高的有機(jī)物濃度有利于特有細(xì)菌群落的生長(zhǎng)和繁殖，而兩組ABR后面隔室中較低的有機(jī)物濃度不利于特有細(xì)菌群落的生長(zhǎng)和繁殖.

與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR前三個(gè)隔室中特有的OTU數(shù)目較少，而最后一個(gè)隔室中特有的OTU數(shù)目較多，這說明彈性填料減少了ABR前三個(gè)隔室中特有的細(xì)菌群落，但增加了ABR最后一個(gè)隔室中特有的細(xì)菌群落.這主要是因?yàn)樘砑訌椥蕴盍鲜褂袕椥蕴盍螦BR各隔室中的生物量有所增加，而兩組ABR進(jìn)水中的有機(jī)物濃度相同，與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR前三個(gè)隔室中特有的細(xì)菌群落所能獲得的有機(jī)物較少，而取樣期間有彈性填料ABR最后一個(gè)隔室中的有機(jī)物濃度可能高于無彈性填料ABR.

圖3 細(xì)菌群落花瓣圖Fig.3 Petal diagram of bacterial community

2.3 Alpha多樣性指數(shù)

Chao1和Observed species指數(shù)用于衡量群落的豐富度，Simpson和Shannon指數(shù)用于衡量群落的多樣性，Pielou’s evenness指數(shù)用于衡量群落的均勻度[15].兩組ABR各隔室中細(xì)菌群落豐富度和均勻度變化如表1所列.由表1可以看出，兩組ABR各隔室中Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)總的趨勢(shì)是沿著水流方向逐漸減小，這說明兩組ABR各隔室中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性總的趨勢(shì)是沿著水流方向逐漸降低，這主要是因?yàn)閮山MABR各隔室中有機(jī)物濃度總的趨勢(shì)是沿著水流方向逐漸降低.與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR前三個(gè)隔室中Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)有所降低，而最后一個(gè)隔室中Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)有所提高，這說明彈性填料降低了ABR前三個(gè)隔室中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，但提高了ABR最后一個(gè)隔室中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性.這主要是因?yàn)樘砑訌椥蕴盍鲜褂袕椥蕴盍螦BR各隔室中的生物量有所增加，而兩組ABR進(jìn)水中的有機(jī)物濃度相同，與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR前三個(gè)隔室中細(xì)菌群落所能獲得的有機(jī)物較少，而取樣期間有彈性填料ABR最后一個(gè)隔室中的有機(jī)物濃度可能高于無彈性填料ABR.兩組ABR各隔室中Pielou’s evenness指數(shù)總的趨勢(shì)是沿著水流方向逐漸減小，這說明兩組ABR各隔室中細(xì)菌群落的均勻度總的趨勢(shì)是沿著水流方向逐漸降低.與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR第1、3隔室中Pielou’s evenness指數(shù)有所降低，而第2、4隔室中Pielou’s evenness指數(shù)有所提高，這說明彈性填料降低了ABR第1、3隔室中細(xì)菌群落的均勻度，但提高了ABR第2、4隔室中細(xì)菌群落的均勻度.

表1 細(xì)菌群落豐富度、多樣性和均勻度變化

2.4 門分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

門分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)圖體現(xiàn)了樣本在門分類水平上細(xì)菌群落的種類和相對(duì)豐度.兩組ABR各隔室中門分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如表2所列.由表2可以看出，兩組ABR各隔室中門分類水平上的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落(相對(duì)豐度達(dá)到1%)包括：Actinobacteria(放線菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Synergistetes(互養(yǎng)菌門)，這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落的平均相對(duì)豐度之和超過80%.有研究表明，變形菌門的存在有利于硝化反硝化作用、生物除磷和污染物的降解[16]，厚壁菌門的存在有利于硝化作用和有機(jī)物的降解[17]，擬桿菌門的存在有利于反硝化作用、蛋白質(zhì)和有機(jī)物的降解[18]，放線菌門的存在有利于氨基酸等有機(jī)物的降解[19]，綠彎菌門的存在有利于溶解性有機(jī)物、EPS和微生物殘?bào)w的降解[20]，互養(yǎng)菌門的存在有利于產(chǎn)甲烷階段的進(jìn)行[21].

表2 門分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

表2中，Synergistetes在兩組ABR各隔室中的平均相對(duì)豐度最高，且兩組ABR各隔室中Synergistetes的相對(duì)豐度沿著水流方向逐漸提高，這說明Synergistetes是兩組ABR各隔室中最具優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌群落，且沿著水流方向逐漸增殖.雖然兩組ABR各隔室中Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi和Proteobacteria的相對(duì)豐度沿著水流方向有所波動(dòng)，但從總的趨勢(shì)來看，兩組ABR各隔室中Firmicutes、Chloroflexi和Proteobacteria的相對(duì)豐度沿著水流方向降低，Actinobacteria的相對(duì)豐度沿著水流方向提高；而Chloroflexi在無彈性填料ABR各隔室中的相對(duì)豐度沿著水流方向降低，在有彈性填料ABR各隔室中的相對(duì)豐度沿著水流方向提高，這說明兩組ABR各隔室中Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi和Proteobacteria沿著水流方向經(jīng)歷了增殖和衰減的交替變化，最終，F(xiàn)irmicutes、Chloroflexi和Proteobacteria出現(xiàn)了衰減，Actinobacteria出現(xiàn)了增殖，而Chloroflexi在無彈性填料ABR中出現(xiàn)了衰減，在有彈性填料ABR中出現(xiàn)了增殖.

與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR第1隔室中Synergistetes的相對(duì)豐度提高較多，Chloroflexi的相對(duì)豐度降低較多；第2隔室中Proteobacteria的相對(duì)豐度提高較多，Bacteroidetes的相對(duì)豐度降低較多；第3隔室中Chloroflexi和Synergistetes的相對(duì)豐度提高較多，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes的相對(duì)豐度降低較多；第4隔室中Proteobacteria和Firmicutes的相對(duì)豐度提高較多，Synergistetes的相對(duì)豐度降低較多.這說明添加彈性填料使ABR第1隔室中Synergistetes增殖較多，Chloroflexi衰減較多；第2隔室中Proteobacteria增殖較多，Bacteroidetes衰減較多；第3隔室中Chloroflexi和Synergistetes增殖較多，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes衰減較多；第4隔室中Proteobacteria和Firmicutes增殖較多，Synergistetes衰減較多.

2.5 屬分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

屬分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)圖體現(xiàn)了樣本在屬分類水平上細(xì)菌群落的種類和相對(duì)豐度.兩組ABR各隔室中屬分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如表3所列.由表3可以看出，兩組ABR各隔室中屬分類水平上的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落包括：Desulfobulbus(脫硫葉菌屬)、Aminiphilus、Syntrophorhabdus(互營(yíng)桿菌屬)、Smithella(史密斯氏菌屬)、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21、Lactivibrio和Desulfomicrobium(脫硫微菌屬)，這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落的平均相對(duì)豐度之和接近15%.

表3中，Desulfomicrobium在兩組ABR各隔室中的平均相對(duì)豐度最高，且兩組ABR各隔室中Desulfomicrobium的相對(duì)豐度沿著水流方向逐漸降低，這說明Desulfomicrobium是兩組ABR各隔室中最具優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌群落，且沿著水流方向逐漸衰減.雖然兩組ABR各隔室中Desulfobulbus、Aminiphilus、Syntrophorhabdus、Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio的相對(duì)豐度沿著水流方向有所波動(dòng)，但從總的趨勢(shì)來看，兩組ABR各隔室中Desulfobulbus和Syntrophorhabdus的相對(duì)豐度沿著水流方向降低，Aminiphilus的相對(duì)豐度沿著水流方向提高；在無彈性填料ABR各隔室中，JGI-0000079-D21的相對(duì)豐度沿著水流方向提高，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Lactivibrio的相對(duì)豐度沿著水流方向降低，而在有彈性填料ABR各隔室中，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio的相對(duì)豐度沿著水流方向變化很小，這說明兩組ABR各隔室中Desulfobulbus、Aminiphilus、Syntrophorhabdus、Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio沿著水流方向經(jīng)歷了增殖和衰減的交替變化，最終，Desulfobulbus和Syntrophorhabdus出現(xiàn)了衰減，Aminiphilus出現(xiàn)了增殖；而在無彈性填料ABR各隔室中，JGI-0000079-D21出現(xiàn)了增殖，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Lactivibrio出現(xiàn)了衰減，在有彈性填料ABR各隔室中，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio增殖和衰減不明顯.

表3 屬分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

與無彈性填料ABR相比，有彈性填料ABR第1隔室中Smithella和JGI-0000079-D21的相對(duì)豐度提高較多，Desulfomicrobium的相對(duì)豐度降低較多；第2隔室中Desulfobulbus和Desulfomicrobium的相對(duì)豐度提高較多；第3隔室中Smithella和Desulfomicrobium的相對(duì)豐度降低較多；第4隔室中Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Desulfomicrobium的相對(duì)豐度提高較多，Aminiphilus、JGI-0000079-D21和Lactivibrio的相對(duì)豐度降低較多.這說明添加彈性填料使ABR第1隔室中Smithella和JGI-0000079-D21增殖較多，Desulfomicrobium衰減較多；第2隔室中Desulfobulbus和Desulfomicrobium增殖較多；第3隔室中Smithella和Desulfomicrobium衰減較多；第4隔室中Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Desulfomicrobium增殖較多，Aminiphilus、JGI-0000079-D21和Lactivibrio衰減較多.

3 結(jié)論

1) 彈性填料提高了ABR第1隔室中的平均COD去除率，降低了第2、3隔室中的平均COD去除率，對(duì)第4隔室中的平均COD去除率影響不大.

2) 彈性填料減少了ABR第1～3隔室中特有的細(xì)菌群落，但增加了ABR第4隔室中特有的細(xì)菌群落.

3) 彈性填料降低了ABR第1～3隔室中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，第1、3隔室中細(xì)菌群落的均勻度；但提高了ABR第4隔室中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，第2、4隔室中細(xì)菌群落的均勻度.

4) 在門分類水平上，添加彈性填料使ABR第1隔室中Synergistetes增殖較多，Chloroflexi衰減較多；第2隔室中Proteobacteria增殖較多，Bacteroidetes衰減較多；第3隔室中Chloroflexi和Synergistetes增殖較多，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes衰減較多；第4隔室中Proteobacteria和Firmicutes增殖較多，Synergistetes衰減較多.

5) 在屬分類水平上，添加彈性填料使ABR第1隔室中Smithella和JGI-0000079-D21增殖較多，Desulfomicrobium衰減較多；第2隔室中Desulfobulbus和Desulfomicrobium增殖較多；第3隔室中Smithella和Desulfomicrobium衰減較多；第4隔室中Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Desulfomicrobium增殖較多，Aminiphilus、JGI-0000079-D21和Lactivibrio衰減較多.