趙武群 ，趙云藍 ，，付 強 △，張家艾 ，孫建國

（1.浙江華海藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺州 317000；2.中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 210009）

多奈哌齊片是一種可逆性中樞乙酰膽堿酯酶抑制藥物，一般日服1次，每個療程為3～6個月[1-2]，主要用于阿爾茨海默病的長期治療[3]。將多奈哌齊與帕莫酸成鹽，開發(fā)成難溶性長效注射劑，可有效解決服藥頻率高、服藥困難等問題[4]。細菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁的產(chǎn)物，若大量進入血液會引發(fā)熱原反應，嚴重者可導致休克甚至死亡[5]，故應嚴格控制注射劑產(chǎn)品中的細菌內(nèi)毒素。帕莫酸多奈哌齊粉末難溶于水，細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET用水）不能完全釋放藥物粉末中包裹的細菌內(nèi)毒素。曾有報道，采用二甲基亞砜（DMSO）[6]、無水乙醇[7-8]、甘露醇[9]等與水互溶的溶劑溶解難溶性藥物并提取其中的細菌內(nèi)毒素。用BET用水進一步稀釋DMSO等溶劑時，已溶解的難溶性粉末會再次析出，存在包裹細菌內(nèi)毒素的風險，造成假陰性干擾。本研究中以二氯甲烷為溶劑，通過細菌內(nèi)毒素檢查法對帕莫酸多奈哌齊注射劑進行質(zhì)量控制，操作簡便，抗干擾能力強。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TAL-40 D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；XS 105 DU型電子天平（梅特勒-托利多國際有限公司，精度為十萬分之一）；Research plus型移液槍（艾本德＜中國＞有限公司）；H1850R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；試驗所用玻璃器皿均采用無菌注射用水清洗，250℃烘烤1 h，除去外源性內(nèi)毒素和其他干擾物質(zhì)。

1.2 試藥

帕莫酸多奈哌齊粉末（實驗室自制，批號分別為17001，17002，18001，規(guī)格為每瓶 255.4 mg）；細菌內(nèi)毒素工作標準品-2（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-201987，效價為80 EU/支）；細菌內(nèi)毒素工作標準品-1（批號為EX 72123，效價為20 EU/mL），鱟試劑 -1（批號為 J 4811 X，靈敏度為 0.062 5 EU/mL，規(guī)格為每瓶1.2 mL），均購自Charles River Endosafe；鱟試劑 -2（批號為 1908122，靈敏度為 0.062 5 EU/mL，規(guī)格為每支0.1 mL），BET用水（批號為1909040，規(guī)格為每瓶50 mL），均購自湛江安度斯生物有限公司；二氯甲烷（西隴科學股份有限公司，批號為180321，規(guī)格為每瓶 500 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細菌內(nèi)毒素限值（L）和稀釋倍數(shù)的確定

根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法[10]，按公式 L=K/M計算。式中，K為人每千克體質(zhì)量每小時最大可接受的細菌內(nèi)毒素劑量，注射劑按5 EU/（kg·h）計算；M為人用每千克體質(zhì)量每小時的最大供試品劑量，人均體質(zhì)量按60 kg計算。

帕莫酸多奈哌齊為長效肌肉注射劑，暫定每月注射1次，最大劑量為每次446.2 mg，相當于每日服用10 mg鹽酸多奈哌齊片[11]。假定每次注射后，所有細菌內(nèi)毒素在1h內(nèi)可完全釋放，其細菌內(nèi)毒素限度值（L）=K/M。其中，K 為 5 EU/（kg·h）；M 為 446.2 mg；人均體質(zhì)量以60 kg計，注射時間不足1 h，按1 h計。結(jié)果 L為0.67 EU/mg。綜合考慮用藥安全和臨床劑量調(diào)整，研究過程中將 L降至0.19 EU/mg。

本研究中采用的鱟試劑靈敏度（λ）為0.0625EU/mL，當 L為0.19 EU/mg時，根據(jù)公式 C=λ/L計算，帕莫酸多奈哌齊最小有效稀釋質(zhì)量濃度為0.33 mg/mL；根據(jù)質(zhì)量濃度為21.12 mg/mL的供試品母液計算最大有效稀釋倍數(shù)為64倍。

2.2 鱟試劑靈敏度復核

根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法復核鱟試劑標示靈敏度[10]。結(jié)果顯示，鱟試劑-1與鱟試劑 -2的靈敏度（λc）分別為 0.5 λ和1λ，在[0.5λ，2λ]范圍內(nèi)，符合藥典規(guī)定。因此，本試驗中的鱟試劑靈敏度均符合要求。

2.3 溶劑篩選

細菌內(nèi)毒素檢查法測定細菌內(nèi)毒素，通常需在水溶液中進行。開發(fā)粉末樣品的凝膠法細菌內(nèi)毒素測定方法時，優(yōu)選BET用水溶解供試品。不能溶于BET用水的樣品，需首先篩選適當?shù)娜軇┤芙夥勰悠?，以完全釋放其中的細菌?nèi)毒素，再使用BET用水稀釋，以消除有機溶劑的干擾[12]。

帕莫酸多奈哌齊粉末不溶于水，易溶于DMSO和二氯甲烷等有機溶劑。當選擇DMSO溶解帕莫酸多奈哌齊粉末時，需使用BET用水稀釋16倍以上才可消除DMSO的干擾。稀釋過程中，帕莫酸多奈哌齊析出的同時可能包裹部分細菌內(nèi)毒素，導致供試品陽性對照（PPC）組出現(xiàn)假陰性。

帕莫酸多奈哌齊在二氯甲烷中的飽和溶解度為26 mg/mL，且二氯甲烷與水混合分層，可有效避免樣品析出與內(nèi)毒素包裹問題，故選擇二氯甲烷作為溶劑，進一步優(yōu)化。為確保帕莫酸多奈哌齊粉末能充分溶解，選擇質(zhì)量濃度為21.12 mg/mL。

2.4 細菌內(nèi)毒素分配系數(shù)測定

細菌內(nèi)毒素的主要成分為脂多糖，是一類具有親水性多聚糖鏈和疏水性脂肪酸尾部的兩親性物質(zhì)。在互不相容的兩相溶劑中，可能會有部分溶解于二氯甲烷，故需考察細菌內(nèi)毒素在二氯甲烷與BET用水中的分配系數(shù)，確定細菌內(nèi)毒素稀釋體積的計算方式。

取二氯甲烷1 mL，加入1 mL 20 EU/mL（即320λ）細菌內(nèi)毒素工作標準溶液，渦旋后離心，取水相分別稀釋成160，320，640，1 280倍系列濃度的溶液進行內(nèi)毒素含量測定。結(jié)果見表1。水相中檢測出的 λt值與 λs值一致，均為0.5λ，內(nèi)毒素回收率為100.00%，表明細菌內(nèi)毒素幾乎全部分布于水層。

表1 細菌內(nèi)毒素分配系數(shù)試驗結(jié)果（鱟試劑-1，批號為J4811X，n=2）Tab.1 The distribution coefficient of bacterial endotoxin（limulus amebocyte lysate-1，batch number：J4811X，n=2）

同時，取二氯甲烷相，加入相同體積的BET用水進行二次萃取，離心，取上層溶液直接進行檢測。結(jié)果顯示，二氯甲烷中未檢出細菌內(nèi)毒素。

分別取 2 λ，1 λ，0.5 λ，0.25 λ 細菌內(nèi)毒素標準溶液1 mL，各加入1 mL二氯甲烷，渦旋后離心，直接取水相進行檢測，作為對照組。詳見表2。結(jié)果對照組的 λt值為1λ。可見，經(jīng)二次萃取的二氯甲烷中細菌內(nèi)毒素含量小于1λ，即細菌內(nèi)毒素在二氯甲烷與BET用水中的分配系數(shù)小于1/320。因此，可采用二氯甲烷溶解難溶性粉末，BET用水萃取的方法進行后續(xù)試驗，細菌內(nèi)毒素濃度僅計算水相體積。

表2 對照組試驗結(jié)果（鱟試劑-1，批號為J4811X，n=2）Tab.2 Results of the control group（limulus amebocyte lysate-1，batch number：J4811X，n=2）

2.5 二氯甲烷干擾試驗

2.5.1 二氯甲烷的影響

二氯甲烷在水中微溶，取二氯甲烷適量，加入等體積BET用水，渦旋混勻后，靜置取水相，分別與等體積4λ，2λ，1λ，0.5 λ的細菌內(nèi)毒素標準溶液混勻，作為試驗組，進行細菌內(nèi)毒素檢測，評估水中溶解的二氯甲烷對細菌內(nèi)毒素凝集反應的干擾。結(jié)果顯示，試驗組與PC組結(jié)果完全一致，λt和 λs均為0.5 λ，表明BET水中溶解的微量二氯甲烷對鱟試劑凝集無干擾。

2.5.2 兩相分配的影響

取1 mL二氯甲烷和1 mL 2 λ細菌內(nèi)毒素工作標準溶液混合，渦旋30 s，使用紅色激光照在暗處，觀察渦旋混勻前后溶液現(xiàn)象。詳見圖1。表明兩親性的細菌內(nèi)毒素分子可能會導致二氯甲烷層形成膠束。

A.渦旋后，二氯甲烷層變?yōu)槿榘咨?B.激光照射時，二氯甲烷層顯示有丁鐸爾效應 C.渦旋后，以6 000 r/min離心5 min，二氯甲烷層變澄清 D.二氯甲烷層丁鐸爾效應減弱 E.二氯甲烷作對照 F.二氯甲烷溶液激光照射未出現(xiàn)丁鐸爾效應圖1 激光照射圖像A.Afterthe vortex，the dichloromethane layerbecame milky white B.There was a Tyndall effect of dichloromethane when the laser irradiated C.The solution after vortex was centrifuged at 6 000 r/min for 5 min，and the dichloromethane layer became clear D.The Tyndall effect of dichloromethane was weakened E.Dichloromethane was taken as reference F.There was no Tyndall effect of dichloromethane when the laser irradiatedFig.1 Image of laser irradiation

為進一步評估分配過程對細菌內(nèi)毒素效價的影響，通過對BET用水飽和的二氯甲烷進行干擾預試驗，確定離心后二氯甲烷不干擾鱟試劑凝集反應的最小稀釋倍數(shù)，再選擇合適的稀釋倍數(shù)進行內(nèi)毒素檢測。

分別取 4λ，2 λ，1λ，0.5λ 細菌內(nèi)毒素標準溶液適量，加入1倍體積二氯甲烷作為供試品貯備液，渦旋后離心，取水相稀釋2倍制備供試液；按同樣方法，分別取水相稀釋 4，8，16，32，64 倍，作為二氯甲烷 PPC 組供試液。同時制備不含細菌內(nèi)毒素標準品的供試液，作為二氯甲烷供試品陰性對照（NPC）組供試液，每個濃度平行2管，進行內(nèi)毒素檢測。結(jié)果見表3?？梢姡x心后需將水相稀釋至8倍以上才可完全消除二氯甲烷的干擾。為了進一步提升方法的可靠性，選擇32倍稀釋倍數(shù)。

表3 二氯甲烷干擾試驗結(jié)果（鱟試劑-1，批號為J4811X，n=2）Tab.3 Interference test results of dichloromethane（limulus amebocyte lysate-1，batch number：J4811X，n=2）

2.6 干擾預試驗

取適量供試品母液，加入1倍體積的BET用水，渦旋后離心，取水相適量，分別用BET用水稀釋8，16，32，64倍，即得NPC組溶液；同時用不同稀釋倍數(shù)的供試品溶液將細菌內(nèi)毒素稀釋成含2 λ細菌內(nèi)毒素標準品的PPC組溶液；并配制含2λ細菌內(nèi)毒素標準品的PC組溶液；BET用水為陰性對照（NC）組溶液；按同樣方法配制二氯甲烷NPC組溶液，含2λ細菌內(nèi)毒素標準品的二氯甲烷供試品陰性對照（PPC）組溶液。結(jié)果見表4。

表4 供試品干擾預試驗結(jié)果（鱟試劑-1，批號為J4811X，n=2）Tab.4 Pre-interference test results of test samples（limulus amebocyte lysate-1，batch number：J4811X，n=2）

由干擾預試驗結(jié)果可知，PC組均為陽性，NC組均為陰性，表明鱟試劑靈敏度符合要求，試驗有效。二氯甲烷PPC組均為陽性，二氯甲烷NPC組均為陰性，表明二氯甲烷不干擾鱟試劑凝集反應。PPC組均為陽性，NPC組均為陰性，表明采用二氯甲烷溶解供試品，BET用水萃取后離心的方法，將分層后得到的水相稀釋8倍以上對鱟試劑凝集反應無干擾作用。供試品干擾試驗選擇將水相稀釋32倍進行試驗，相當于0.66 mg/mL作為供試品溶液稀釋質(zhì)量濃度。

2.7 干擾試驗

取3批供試品，按2.6項下方法，選擇終點稀釋倍數(shù)32倍配制各組供試液（詳見表5），供試品溶液最終稀釋質(zhì)量濃度相當于0.66 mg/mL。根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》通則細菌內(nèi)毒素檢查法使用2個廠家的鱟試劑對3批供試品進行干擾試驗。試驗結(jié)果見表6。

干擾試驗結(jié)果表明，NC組均為陰性，PC組與3批供試品PPC組均為陽性，說明鱟試劑靈敏度合格，試驗有效；二氯甲烷NPC組均為陰性，二氯甲烷PPC組均為陽性，說明二氯甲烷質(zhì)量符合要求，不干擾鱟試劑凝集反應；NPC組均為陰性，說明帕莫酸多奈哌齊中細菌內(nèi)毒素未超過規(guī)定限度，質(zhì)量符合藥用要求。

表5 各組供試液配制方法Tab.5 Preparation method of test solution for each group

表6 供試品干擾試驗結(jié)果Tab.6 Interference test results of test samples

2.8 擬訂的內(nèi)毒素檢測方法

稱取帕莫酸多奈哌齊粉末適量，加入二氯甲烷溶解，制成21.12 mg/mL的供試品母液。按表5所述，取1 mL供試品母液或二氯甲烷，與1 mL BET用水混合得貯備液，渦旋30 s，充分萃取二氯甲烷中的細菌內(nèi)毒素，6 000 r/min離心5 min，使水相與二氯甲烷相分層；取水相進一步稀釋，制備供試液。

取鱟試劑加樣，在（37±1）℃的試管恒溫儀中培養(yǎng)（60±2）min。試驗結(jié)果“+”為陽性，代表形成凝膠且倒置不脫落；“-”為陰性，代表未形成凝膠或形成凝膠但倒置脫落。

當NPC組和NP組的所有平行管均為陰性時，按公式 λ=antilg（∑X/n）計算細菌內(nèi)毒素反應終點濃度的幾何平均值。其中，λs為PC組反應終點濃度的幾何平均值，λt為除PC組外的供試液反應終點濃度的幾何平均值，X代表反應終點濃度的對數(shù)值。

3 討論

細菌內(nèi)毒素與鱟試劑的反應是一系列酶促反應，需要在水溶液中進行。帕莫酸多奈哌齊是一種難溶性藥物，在水中難溶，導致其中包裹的細菌內(nèi)毒素不能全部檢出而無法有效控制注射劑中的細菌內(nèi)毒素限度。難溶性液體中的細菌內(nèi)毒素可直接用BET用水進行萃取檢測，而難溶性固體需先選擇合適的溶劑將其全部溶解，進一步處理后再檢測。晏成倩等[12]報道，采用DMSO溶解難溶性原料藥進行細菌內(nèi)毒素檢測。當采用DMSO等與水互溶的有機溶劑溶解帕莫酸多奈哌齊粉末時，由于加入BET用水后有藥物析出，析出部分可能包裹一定量的細菌內(nèi)毒素而導致出現(xiàn)假陰性干擾，故選用二氯甲烷作為溶劑進行細菌內(nèi)毒素檢測。

本研究中采用凝膠法檢測細菌內(nèi)毒素，首先考察細菌內(nèi)毒素在二氯甲烷與BET用水中的分配系數(shù)，證明細菌內(nèi)毒素主要分布于水相；考察二氯甲烷對鱟試劑凝集反應的干擾，結(jié)果表明，將離心后的水相稀釋至8倍以上可消除溶劑干擾；供試品干擾試驗中，將二氯甲烷稀釋32倍不干擾鱟試劑凝集反應，表明本方法適用于帕莫酸多奈哌齊中細菌內(nèi)毒素的控制。