miR-218通過靶向TNFR1抑制破骨細(xì)胞分化并預(yù)防骨質(zhì)疏松癥*

張建業(yè) 張衛(wèi)華 韓俊 陳東

(武漢科技大學(xué)附屬漢陽(yáng)醫(yī)院·武漢市漢陽(yáng)醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430050)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種常見的慢性代謝性骨病，其特征在于骨礦物質(zhì)密度低和創(chuàng)傷小[1]。作為絕經(jīng)后婦女的常見疾病，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的主要機(jī)制是雌激素水平降低導(dǎo)致骨形成與骨吸收之間的不平衡[2-3]。中國(guó)是全球老年人口最多的國(guó)家，據(jù)估計(jì)至少有9000萬(wàn)人患有骨質(zhì)疏松癥，到2050年，這一數(shù)字將增加到2.21億[4]。骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性疾病，主要影響全世界的老年人，尤其是婦女[5]，因此需要在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥方面進(jìn)行改進(jìn)。MicroRNA(miRNA或miRs)是小非編碼單鏈RNA家族，可通過結(jié)合3′非翻譯區(qū)(UTR)負(fù)調(diào)控靶基因在各種細(xì)胞(包括增殖，凋亡和分化)中的表達(dá)[6-7]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA參與了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展，包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[8-9]，例如，miR-124通過調(diào)節(jié)NFATc1表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化[10]。miR-218在多種癌細(xì)胞中都有表達(dá)[11-13]，然而miR-218對(duì)成骨分化有一定的影響[14]。但是，miR-218是否參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展仍不清楚，因此需要進(jìn)一步研究。TNFR1是TNF的細(xì)胞膜受體，屬于TNF受體超家族[15]。TNF通過兩個(gè)細(xì)胞表面受體TNFR1和TNFR2發(fā)出信號(hào)，且TNFR1啟動(dòng)了TNF的大部分生物活性[16]。研究表明，TNF在骨質(zhì)疏松癥發(fā)展中的作用，例如，TNF/TNFR1通過Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)抑制信號(hào)量3B，從而抑制了雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥的骨形成[17]。TNFR1在破骨細(xì)胞形成中研究甚少，需要進(jìn)一步了解。在本研究中，我們旨在闡明miR-218在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮的作用，并探討其分子機(jī)制；分析miR-218對(duì)TNFR1靶向作用機(jī)制，進(jìn)一步闡明miR-218在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮的作用而奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雌性C57BL/6J小鼠(體重20±2g)購(gòu)自武漢科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì)計(jì)劃嚴(yán)格經(jīng)過我院倫理委員會(huì)審查。將實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物房(溫度為23±2℃，濕度為50～60%，光照/黑暗周期為12 h)。兩周適應(yīng)環(huán)境，正常飲水飲食。

1.1.2 細(xì)胞 人胚腎(HEK-293T)細(xì)胞株細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。HEK-293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，2 d更換一次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)成分。取對(duì)數(shù)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。M-CSF、RANKL和TRAP染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。帶有熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照、miR-218 mimics和miR-218 inhibitor由Genepharma公司合成。TRIzol試劑、PrimeScriptTMRT Reagen試劑盒、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒和SYBR?Premix EX TaqTMII試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)promega公司。RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。兔抗TNFR1抗體、兔抗β-actin抗體和山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 骨質(zhì)疏松癥模型建立 將小鼠隨機(jī)分為卵巢切除組(OVX，n=10)和假手術(shù)組(sham，n=10)。采用雙側(cè)卵巢切除法建立去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型。造模前，小鼠禁食12 h，腹腔注射1%水合氯醛麻醉，OVX組小鼠從腹部分離并切除雙側(cè)卵巢；sham組小鼠僅開放/閉合腹部，無(wú)卵巢切除；術(shù)后縫合傷口，計(jì)手術(shù)當(dāng)周為第0周，連續(xù)肌肉注射4 d抗生素(氨芐青霉素，4×104U/d)，第12周進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 μCT分析 使用μCT系統(tǒng)以及SKYSCAN?CT分析軟件對(duì)X射線圖像(體素大小為9μm)進(jìn)行采集并重建脛骨近端和L1-L5腰椎的顯微結(jié)構(gòu)，記錄骨質(zhì)疏松癥的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，包括骨礦質(zhì)密度(BMD)，相對(duì)于組織體積的骨體積(BV/TV)，小梁厚度(Tb.Th)。

1.2.3 骨髓單核細(xì)胞(BMMs)的分離培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下快速取出小鼠雙側(cè)股骨和脛骨(OVX組、sham組或正常組)。剪斷骨骺端，用α-MEM培養(yǎng)基輕輕沖洗股骨和脛骨的髓腔，洗滌4-5次。收集含有骨髓的α-MEM培養(yǎng)基于離心管中，1000 rpm離心15 min后丟棄懸液。離心管中加入5 mL紅細(xì)胞裂解緩沖液重懸細(xì)胞并輕輕吹打。室溫下?lián)u勻靜置5 min后加入α-MEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。1000 rpm離心15 min后丟棄懸液。用20 mL α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞按5×106個(gè)/孔接種到10 cm的培養(yǎng)皿中，并加入9 mL α-MEM培養(yǎng)基和20 ng/mL M-CSF，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，1 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)2 d后用PBS溶液沖洗掉不能附著在培養(yǎng)皿的底面的細(xì)胞，再繼續(xù)培養(yǎng)3 d，得到BMMs。

1.2.4 骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化 從正常組小鼠中收獲BMMs進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。將BMMs用含有M-CSF(20 ng/mL)、RANKL(50 ng/mL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，使BMMs細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。分別于0、1、3、5 d通過TRAP染色評(píng)估培養(yǎng)物中誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將BMMs接種在12孔板中(5×104個(gè)/mL)，按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書將100 nM miR-218模擬物，150 nM miR-218抑制劑或陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至BMMs細(xì)胞中。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。然后，更換培養(yǎng)基并加入M-CSF和RANKL一起培養(yǎng)3 d。

1.2.6 qRT-PCR 用TRIzol試劑提取組織樣本或者細(xì)胞總RNA。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和含量，并將每個(gè)配對(duì)的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。使用PrimeScriptTMRT Reagen試劑盒將提取的RNA(miRNA)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒將提取的RNA(mRNA)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix EX TaqTMII試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。使用FTC-3000p實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)完成實(shí)驗(yàn)后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。其中使用的引物見表1。

表1 引物序列

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-218的靶基因。將TNFR1 3′UTR wt/mut克隆到pmirGLO載體中，然后將control、miR-218 mimics、pmirGLO-TNFR1-wt、pmirGLO-TNFR1-mut、轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。48 h后，應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定HEK293T細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.8 TRAP染色 培養(yǎng)結(jié)束后的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。PBS溶液洗滌3次，每次5 min。之后用含有45 mL去離子水，0.5 mL混合Fast Garnet GBC基礎(chǔ)溶液，0.5 mL亞硝酸鈉溶液，0.5 mL萘酚AS-BI磷酸鹽溶液，2 mL乙酸鹽溶液和1 mL酒石酸鹽溶液的混合溶液處理細(xì)胞，并在37°C下孵育1 h，然后用去離子水洗滌。晾干后觀在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄TRAP陽(yáng)性的多核破骨細(xì)胞。

1.2.9 Western blot 培養(yǎng)結(jié)束后的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次后，加入1 mL制備好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白含量。用12% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含有5%脫脂牛奶的PBS溶液封閉膜1 h，然后加入稀釋后的TNFR1和β-actin一抗，4℃搖床上孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，加入對(duì)應(yīng)于一抗種屬來(lái)源的HRP標(biāo)記的二抗，在室溫?fù)u床上孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松癥小鼠BMMs中miR-218水平下調(diào) 使用μCT對(duì)sham組和OVX組小鼠進(jìn)行掃描，結(jié)果表明：與sham組相比，OVX組小鼠的BMD、BV/TV和Tb.Th指數(shù)下降(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，說(shuō)明骨質(zhì)疏松癥小鼠造模成功，見圖1A。為了研究sham-BMMs和OVX-BMMs中miR-218表達(dá)的差異，進(jìn)行了qRT-PCR，結(jié)果表明，miR-218在OVX-BMMs中的表達(dá)明顯低于sham-BMMs(P<0.01)，見圖1B。

圖1 miR-218在從OVX小鼠分離的BMMs中低表達(dá)

2.2 miR-218在破骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)下調(diào) 從正常組小鼠分離的BMMs用M-CSF(20 ng/mL)和RANKL(50 ng/mL)處理不同的時(shí)間段(1 d，3 d和5 d)以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，結(jié)果表明，隨著處理天數(shù)的增加，成熟破骨細(xì)胞標(biāo)志物：NFATc1 mRNA和TRAF6 mRNA表達(dá)增加(P<0.05，見圖2A)，TRAP染色逐漸增強(qiáng)，見圖2B。此外，在第1、3和5 d進(jìn)行了qRT-PCR，結(jié)果表明，在分化為破骨細(xì)胞后，BMMs中的miR-218明顯降低，見圖2C。

圖2 miR-218在破骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)下調(diào)。

2.3 上調(diào)miR-218抑制BMMs的破骨細(xì)胞分化 為了研究miR-218在破骨細(xì)胞分化中的作用，將miR-218 mimics、miR-218 inhibitor和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入BMMs細(xì)胞，并誘導(dǎo)其分化。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(圖3A)，并通過qRT-PCR證實(shí)了miR-218的表達(dá)(圖3B)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。qRT-PCR檢測(cè)了NFATc1和TRAF6在不同組中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與control組比較，miR-218 mimics組NFATc1 mRNA和TRAF6 mRNA的表達(dá)下調(diào)(P<0.01，P<0.05)，miR-218 inhibitor組NFATc1 mRNA和TRAF6 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01，P<0.01)(圖3C)。此外，進(jìn)行了TRAP染色以檢測(cè)破骨細(xì)胞的分化(圖3D)，結(jié)果表明，上調(diào)miR-218抑制了破骨細(xì)胞的分化，下調(diào)miR-218顯著刺激了破骨細(xì)胞分化。

圖3 上調(diào)miR-218抑制BMMs的破骨細(xì)胞分化

2.4 TNFR1是miR-218的直接靶標(biāo) TargetScan預(yù)測(cè)miR-218和TNFR1之間的結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)粒攜帶TNFR1 3′UTR wt時(shí)，miR-451 mimics抑制HET293T細(xì)胞中的熒光素酶活性(P<0.001)，但當(dāng)質(zhì)粒攜帶TNFR1 3′UTR mut時(shí)，未抑制熒光素酶活性，見圖4B。

圖4 miR-218與TNFR1的關(guān)系

2.5 上調(diào)miR-218抑制TNFR1的表達(dá) Western blot結(jié)果表明，隨著BMMs被誘導(dǎo)分化天數(shù)的增加，TNFR1蛋白表達(dá)逐漸增加(P<0.05，圖5A)；與control組比較，miR-218 mimics組中TNFR1蛋白表達(dá)增加，miR-218 inhibitor組中TNFR1蛋白表達(dá)增加。結(jié)果表明，結(jié)果表明，下調(diào)BMMs中的miR-218會(huì)增加TNFR1蛋白表達(dá)。

圖5 Western blot檢測(cè)TNFR1蛋白的表達(dá)水平

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種常見疾病，其特征是全身性骨質(zhì)破壞和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，已成為主要的公共衛(wèi)生問題，受到了廣泛的關(guān)注[18]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與多種疾病的病理生理過程有密切關(guān)系[19]，例如，miR-338-3p能抑制破骨細(xì)胞活性，緩解骨質(zhì)疏松發(fā)生[20]。然而miR-218在多個(gè)組織中表達(dá)以調(diào)節(jié)不同的病理生理過程，如癌癥的發(fā)展[21-22]，作為妊娠期高血壓疾病新的治療方法，了解發(fā)病機(jī)理[23]。因此，miR-218參與了多種疾病的進(jìn)程。

近年來(lái)，miR-218與骨吸收之間的關(guān)系已得到廣泛研究。例如，孫璇等[14]發(fā)現(xiàn)miR-218對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化有影響，但是，關(guān)于miR-218與破骨細(xì)胞形成之間的關(guān)系研究甚少，仍然存在很多不確定性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-218在OVX小鼠的BMMs中表達(dá)水平下降。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用M-CSF和RANKL誘導(dǎo)后，正常組小鼠BMMs隨著誘導(dǎo)分化的時(shí)間增加，miR-218的表達(dá)水平下調(diào)。我們進(jìn)一步研究miR-218是否對(duì)破骨細(xì)胞分化有調(diào)節(jié)作用，使用miR-218抑制劑和模擬物來(lái)下調(diào)或上調(diào)miR-218的表達(dá)。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-218減弱了BMMs中的破骨細(xì)胞分化，而低表達(dá)miR-218則促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化。這些結(jié)果表明，miR-218是BMMs破骨細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)劑。接下來(lái)，我們嘗試尋找miR-218的靶標(biāo)。通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)TNFR1可能是miR-218的潛在靶基因。

研究指出，TNFR1與許多疾病的發(fā)展和進(jìn)步有關(guān)。例如，發(fā)現(xiàn)TNFR1促進(jìn)腺瘤性息肉與胃癌的發(fā)生發(fā)展[24]。TNFR1過表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞從而介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[25]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，TNFR1對(duì)2型糖尿病引起的骨再生及其修復(fù)障礙有作用[26]。在本研究中，我們使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法證明TNFR1是miR-218的直接靶標(biāo)。miR-218的過度表達(dá)導(dǎo)致TNFR1明顯減少，從而損害破骨細(xì)胞的正常功能。所有這些結(jié)果表明，miR-218通過抑制TNFR1的表達(dá)來(lái)抑制破骨細(xì)胞形成。

4 結(jié)論

我們的研究證明了miR-218通過抑制TNFR1表達(dá)來(lái)抑制BMMs的破骨細(xì)胞分化。更重要的是，過表達(dá)miR-218可以抑制BMMs的破骨細(xì)胞分化，這表明miR-218可能是治療骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶標(biāo)。