王卓琳，崔建梅，周琛斐，劉曉慧，王 超，高 薇，蘇曉云

抑郁癥(Major DePressive Disorder，MDD)是世界上最常見的精神障礙類疾病。目前全球抑郁癥患病人群累計超過3.5億人，其中女性的患病率(5.1%)明顯高于男性(3.6%)[1]。圍絕經(jīng)期抑郁癥是由卵巢功能衰退、雌激素水平不穩(wěn)定導(dǎo)致的情感障礙類疾病。Shin等[2]通過對臺灣南部266名44～55歲女性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該年齡段患抑郁癥概率高達(dá)31.2%。Freeman等[3]通過整理2005年以來國家衛(wèi)生研究院《科學(xué)狀況報告》發(fā)現(xiàn)，有抑郁癥史女性在圍絕經(jīng)期間患嚴(yán)重抑郁癥概率是絕經(jīng)前女性的五倍，沒有抑郁癥史女性在圍絕經(jīng)期間患嚴(yán)重抑郁癥概率是絕經(jīng)前女性的2～4倍。由此可見，圍絕經(jīng)期女性是抑郁癥的高發(fā)人群。目前，臨床上常用雌激素替代療法治療抑郁癥，但在治療過程中會增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜增生等疾病患病風(fēng)險[4]。此外，長期患病及高額治療可加重家庭負(fù)擔(dān)。因此，尋求一種短期、安全、高效的治療方法顯得尤為重要。近年來，人們清楚地認(rèn)識到體育活動可促進(jìn)身心健康、參與情感調(diào)控、緩解抑郁癥狀[5]。有研究證明，4周中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對慢性應(yīng)激大鼠抑郁行為具有一定改善[6]。Blumenthal等研究發(fā)現(xiàn)16周有氧運(yùn)動與抗抑郁藥物在減輕抑郁方面有類似效果[7]。但是運(yùn)動對雌激素缺乏所導(dǎo)致抑郁模型相關(guān)研究較少，其潛在機(jī)制也尚不清楚。

海馬體(HiPPocamPus)位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，屬于邊緣系統(tǒng)的一部分。作為情感調(diào)控的高級中樞，其與抑郁癥的關(guān)系也備受人們關(guān)注。有學(xué)者認(rèn)為，中樞海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)過度激活，可能是抑郁癥發(fā)病機(jī)制之一。Wang等[8]通過正電子發(fā)射型計算機(jī)斷層顯像(PET)檢測發(fā)現(xiàn)12周慢性應(yīng)激誘發(fā)產(chǎn)生的抑郁癥存在促炎因子IL-1、IL-6的過度激活[9]。此外，在患有嚴(yán)重抑郁癥患者血清和腦脊液中發(fā)現(xiàn)促炎因子(IL-1β，IL-6，IL-8，IL-12，IFN-γ，TNF-α)含量增多及抗炎因子IL-10水平下降[10]。一氧化氮(NO)是參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如抑郁癥、精神分裂癥等)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，而神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)在調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生與釋放中起著重要作用。已有研究表明，運(yùn)動可以通過抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，從而緩解抑郁癥狀。屈紅林[11]等研究發(fā)現(xiàn)8周有氧運(yùn)動可以拮抗抑郁小鼠海馬組織炎癥，促進(jìn)損傷的海馬組織修復(fù)，改善慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)抑郁小鼠海馬功能。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)4～8周中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動可以抑制睡眠剝奪大鼠海馬炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)海馬nNOS的表達(dá)，改善抑郁樣行為[12,13]。但運(yùn)動是否可以通過調(diào)節(jié)海馬炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)及海馬nNOS釋放改善圍絕經(jīng)期大鼠抑郁樣行為尚不清楚。因此，本研究通過去卵巢術(shù)建立圍絕經(jīng)期抑郁模型，觀察4周跑臺運(yùn)動后去卵巢大鼠抑郁樣行為、海馬炎癥因子及海馬CA1、CA3區(qū)nNOS水平變化并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

本研究選用SPF級雌性健康成年大鼠(三月齡)30只。起始體重為(240g～280g)，采購于山西醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心，飼養(yǎng)于通風(fēng)良好、干凈衛(wèi)生、可隨意獲得水和食物的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室溫度(22℃±23℃)、濕度(55%±10%)、光照與黑暗周期為12h(7：00—19：00)。適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1周后，將以上大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為假手術(shù)組(SHAM)、去卵巢組(OVX)、去卵巢運(yùn)動組(OVX+EX)。

1.2 卵巢切除模型的建立

使用戊巴比妥鈉(0.5ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定四肢，剪去腹部被毛，用碘伏棉簽進(jìn)行擦拭消毒腹部皮膚，順著腹白線做3cm左右的切口，在腹腔中先找到子宮，沿著輸卵管定位卵巢位置(成粉紅色球狀，直徑0.5cm左右)，結(jié)扎血管后切除雙側(cè)卵巢。手術(shù)完成后，緩慢將子宮放入腹腔，隨后縫合好皮膚與組織繼續(xù)回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組起始步驟與手術(shù)組相同，但手術(shù)中不切除卵巢而是切除卵巢周圍一小部分脂肪。為所有大鼠均給予青霉素(20 000u/kg/d)肌肉注射，以避免感染?；謴?fù)期內(nèi)每日進(jìn)行陰道涂片檢查。如若連續(xù)五天無動情周期證明造模成功。

1.3 中等強(qiáng)度跑臺訓(xùn)練方案

適應(yīng)1周環(huán)境后，OVX+EX組大鼠進(jìn)行4周中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動，跑速為15～20 m/min的跑臺上訓(xùn)練60min(坡度為5%)。一周運(yùn)動五天(周一到周五下午3點(diǎn)進(jìn)行)，每周六、日休息兩天。實(shí)驗(yàn)過程中不會使用任何刺激對大鼠進(jìn)行驅(qū)趕，以免產(chǎn)生不良應(yīng)激反應(yīng)。

1.4 抑郁樣行為測試

1.4.1 曠場試驗(yàn)(Open field test，OFT)在照明強(qiáng)度維持恒定且安靜的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。將每只大鼠放置在周壁為黑色(100cm×100cm×50cm)的實(shí)驗(yàn)箱中，試驗(yàn)箱的底面用黑線分成25個相等的正方形。將攝像機(jī)放于離測試設(shè)備5m的控制面板上，大鼠放入中央格，觀察大鼠5 min內(nèi)進(jìn)入中心格次數(shù)、中心格時間百分比、跨格及直立總次數(shù)。

1.4.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(Forced swimming Test，F(xiàn)ST)將大鼠放在豎直的塑料圓桶中(直徑20 cm、高40 cm)中，水位30 cm(防止老鼠在游泳過程中用后肢或尾巴觸碰圓桶底部來支撐自己)，水溫(23±2)℃。攝像機(jī)置于圓桶上方全程記錄，強(qiáng)迫游泳6 min，記錄后4 min攀爬時間以及不動的時間。測試完成后，用毛巾輕輕擦拭后吹風(fēng)機(jī)吹干大鼠，繼續(xù)回籠飼養(yǎng)。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

行為測試結(jié)束后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)進(jìn)行麻醉，將大鼠斷頭取腦剝離海馬，稱重后加入0.9%的生理鹽水制成10%海馬組織勻漿，以4 000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心15min，離心后取上清液后測試海馬炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

行為測試結(jié)束后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)進(jìn)行麻醉，開胸后使用針尖插入升主動脈，用冷生理鹽水300ml迅速沖洗血管，然后輸入300ml 4%多聚甲醛(0.1mol/LPBS，PH 7.4)，再輸入300ml10%蔗糖PBS溶液，先快后慢，結(jié)束后即刻取腦，置于4%多聚甲醛PBS溶液中，4℃固定2h，再浸入4℃ 20%蔗糖PBS溶液(PH 7.2～7.4)保存過夜。腦組織完全沉底后，將腦冠狀位連續(xù)切成30μm厚的冰凍切片，隔4張取1張，然后將切片放入0.1%Triton X-100 PBS溶液(37℃)中孵育1h，加10%的山羊血清工作液孵育封閉1h，再加入nNOS血清第一抗體(1∶100)37℃孵育1h，隨后加入37℃羊抗兔IgG第二抗體孵育1h，DAB呈色30min后置入0.2%明膠溶液裱片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.7 圖像分析和統(tǒng)計學(xué)處理

根據(jù)腦立體定位圖譜確定海馬CA1、CA3區(qū)的位置，用數(shù)碼顯微鏡以及形態(tài)學(xué)軟件對nNOS陽性神經(jīng)元表達(dá)進(jìn)行分析，在顯微鏡400倍鏡視野下計算出nNOS陽性神經(jīng)元個數(shù)以及面積。采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示；使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1結(jié)果顯示：與SHAM組比較，OVX組大鼠中央格次數(shù)、中央格時間百分比及總運(yùn)動能力(跨格+直立次數(shù))均顯著下降(P均=0.000)，下降幅度分別為46%、45%、28%，說明大鼠活動度降低，探索能力下降，出現(xiàn)抑郁樣表現(xiàn);與OVX組比較， OVX+EX組大鼠中央格次數(shù)、中央格時間百分比及總運(yùn)動能力顯著增加(P=0.018、P=0.047、P=0.017)，增加幅度分別為28%、21%、55%，說明通過4周跑臺運(yùn)動可以提高去卵巢大鼠活動度，增強(qiáng)大鼠探索行為。

表1 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 各組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，與SHAM組比較，OVX組大鼠不動時間顯著增加，攀爬時間顯著下降(P=0.000)，不動時間增幅為25%，攀爬時間降幅為8%；與OVX組比較，OVX+EX組大鼠不動時間顯著下降(P=0.018)，攀爬時間顯著上升(P=0.003)，不動時間降幅為29%，攀爬時間增幅為12%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，通過4周的跑臺運(yùn)動可以改善去卵巢大鼠絕望樣抑郁行為。

表2 各組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 各組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6以及TNF-α結(jié)果

從表3可以看出，與SHAM組相比較，OVX組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6以及TNF-α顯著增加(P均=0.000)，增加的幅度分別為14%、33%、69%；與OVX組比較，OVX+EX組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α顯著下降(P=0.000、P=0.030、P=0.003)下降幅度分別為18%、7%、15%。說明4周跑臺運(yùn)動可以抑制海馬炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

表3 各組大鼠海馬炎癥因子結(jié)果

2.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)nNOS表達(dá)結(jié)果

從表4可以看出，與SHAM組相比較，OVX組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS免疫陽性產(chǎn)物的面積及陽性細(xì)胞數(shù)量、CA3區(qū)nNOS免疫陽性產(chǎn)物的面積及免疫陽性數(shù)量均有顯著下降(P=0.000)，下降幅度分別為34%、32%、46%、40%;與OVX組比較，OVX+EX組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS免疫陽性產(chǎn)物的面積及陽性細(xì)胞數(shù)量、CA3區(qū)nNOS免疫陽性產(chǎn)物的面積及免疫陽性數(shù)量均顯著增加(P=0.000、P=0.000、P=0.000、P=0.012)，增加幅度分別為12%、17% 、16%、15% 。

表4 各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)nNOS表達(dá)結(jié)果

3 討論

3.1 跑臺運(yùn)動對去卵巢大鼠抑郁行為的影響

許多學(xué)者認(rèn)為雌激素對腦部具有廣泛的影響，不僅參與生理和心理過程，且對情感認(rèn)知具有調(diào)控作用[14]。Lu等[15]通過懸尾實(shí)驗(yàn)及曠場實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，成年雌性大鼠經(jīng)過雙側(cè)卵巢切除術(shù)后會出現(xiàn)行為絕望等抑郁樣表現(xiàn)。Maik等[16]在臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)切除子宮女性與未切除子宮女性相比患抑郁癥的機(jī)率增加78%。本研究結(jié)果表明：雌激素水平的下降與抑郁癥發(fā)生具有一定的相關(guān)性。具體表現(xiàn)為，與SHAM組比較，OVX組大鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中活動探索能力下降，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動時間延長以及攀爬時間縮短，說明卵巢摘除大鼠自主活動和探索行為減少，出現(xiàn)了絕望無助等抑郁行為的核心癥狀，證實(shí)雌激素下降可誘導(dǎo)出抑郁行為，證實(shí)建模成功。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)體育鍛煉對情緒的調(diào)控具有積極作用，劉威等[17]通過對8周中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動與氟西汀(抗抑郁藥)干預(yù)對比發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動干預(yù)可以取得與氟西汀治療相似的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，與OVX組比較，OVX+EX組探索能力及自主活動能力顯著提高，表明有氧運(yùn)動可作為藥物治療抑郁癥的良好替代手段，進(jìn)一步證實(shí)了體育鍛煉具有良好的抗抑郁作用。

SHAM組OVX組OVX+E組

SHAM組OVX組OVX+E組

3.2 跑臺運(yùn)動對去卵巢大鼠海馬炎癥因子的影響

越來越多的證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)作為機(jī)體的防御系統(tǒng)與抑郁癥之間具有密切聯(lián)系。海馬作為雌激素作用靶點(diǎn)，激素水平迅速下降可通過釋放炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂，進(jìn)而出現(xiàn)“抑郁炎癥反應(yīng)”[19]。TNF-α是單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種生物活性的多肽促炎細(xì)胞因子，可以激活T細(xì)胞，促進(jìn)IL-1、IL-6產(chǎn)生及分泌。近年來，實(shí)驗(yàn)觀察及臨床研究表明，促炎癥細(xì)胞因子(IL-1、IL-6 、TNF-α、C-反應(yīng)蛋白)可以導(dǎo)致內(nèi)分泌功能紊亂及抑郁行為的改變[20]。郝文宇等[9，21]發(fā)現(xiàn)下丘腦IL-1β過度表達(dá)會引起海馬神經(jīng)元損傷與凋亡，導(dǎo)致海馬功能異常，從而加重抑郁癥癥狀及腦組織損傷。此外，Zhao等[22]也在抑郁小鼠血清及大腦相關(guān)區(qū)域(前額皮層、海馬和紋狀體)中發(fā)現(xiàn)炎癥因子(TNF-α、IL-1、IL-6)表達(dá)顯著增多。本研究得到相同結(jié)果。與SHAM組比較，OVX組大鼠海馬中炎癥細(xì)胞因子(IL-1、IL-6 、TNF-α)水平增加，證實(shí)了圍絕經(jīng)期抑郁大鼠存在海馬炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動鍛煉后骨骼肌中IL-6濃度可以增加到100倍以上，可刺激抗炎因子(IL-10等)的產(chǎn)生，抑制促炎因子(TNF-α、IL-1、IL-6 、IL-8)的分泌，起到間接抗炎作用。本研究結(jié)果表示，與OVX組比較，OVX+EX組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平均顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)運(yùn)動可以抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)海馬抗炎能力，改善OVX大鼠抑郁癥狀。

3.3 跑臺運(yùn)動對去卵巢大鼠海馬CA1、CA3區(qū)nNOS表達(dá)的影響

NO作為一種新型神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，在情感障礙、抑郁癥、精神分裂癥等疾病中起重要作用，而nNOS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的一氧化氮合酶亞型，催化產(chǎn)生NO[23]。因此，在病理學(xué)研究中，調(diào)節(jié)nNOS表達(dá)水平可能是治療情感障礙的潛在靶點(diǎn)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激42天后海馬nNOS陽性產(chǎn)物的表達(dá)顯著減少，腦組織損傷，并引起抑郁樣相關(guān)癥狀[24]。本研究結(jié)果顯示：與SHAM組比較，OVX組大鼠CA1、CA3區(qū)nNOS陽性細(xì)胞數(shù)量及產(chǎn)物減少。但有研究證明在慢性應(yīng)激早期抑郁大鼠海馬中發(fā)現(xiàn)nNOS免疫陽性細(xì)胞數(shù)量和面積均顯著增加[25]。有學(xué)者認(rèn)為慢性應(yīng)激早期11天左右nNOS陽性反應(yīng)最強(qiáng)，到了21天以后nNOS表達(dá)逐漸減少，但早期過量的nNOS陽性反應(yīng)產(chǎn)生的NO細(xì)胞毒性作用而導(dǎo)致部分神經(jīng)元的功能和形態(tài)損傷，其累積產(chǎn)生的卻并未減少[26]。因此認(rèn)為海馬nNOS表達(dá)具有雙重狀態(tài)，與應(yīng)激后時間相關(guān)，在應(yīng)激早期(7～11天)海馬nNOS表達(dá)增加，NO的合成能力增強(qiáng)，過量NO從神經(jīng)調(diào)節(jié)遞質(zhì)轉(zhuǎn)變成具有神經(jīng)毒性作用導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的凋亡；到了應(yīng)激晚期(21天以后)海馬神經(jīng)元損傷及凋亡導(dǎo)致體積縮小，使海馬中nNOS表達(dá)減弱、活性下降。本實(shí)驗(yàn)檢測的是去卵巢后43天的圍絕經(jīng)期抑郁模型大鼠。結(jié)果顯示OVX組海馬體中nNOS表達(dá)顯著下降，而經(jīng)過4周跑臺運(yùn)動后海馬nNOS表達(dá)增加，抑郁樣行為也有明顯改善。因此我們認(rèn)為，抑郁行為改善可能與海馬體中nNOS含量減少所導(dǎo)致NO神經(jīng)毒性減弱有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)4周中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動可以改善去卵巢大鼠抑郁樣行為，可能是通過增強(qiáng)海馬CA1、CA3區(qū)nNOS蛋白的表達(dá)及活性，增加NO釋放，抑制海馬體中炎癥反應(yīng)。因此，定期體育鍛煉可作為抑郁癥狀緩解的非藥物干預(yù)手段，但情感疾病動物模型可能不完全符合人類狀況。相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

(1)雌性成年健康大鼠切除卵巢后海馬促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)產(chǎn)生增多，海馬CA1、CA3區(qū)nNOS免疫陽性細(xì)胞的數(shù)量和陽性細(xì)胞面積顯著下降，出現(xiàn)抑郁樣行為。

(2)經(jīng)過4周中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動的干預(yù)可以改善去卵巢大鼠的抑郁樣行為，增強(qiáng)海馬炎癥反應(yīng)及海馬CA1、CA3區(qū)nNOS免疫陽性細(xì)胞的數(shù)量及陽性細(xì)胞面積。

(3)4周跑臺運(yùn)動改善去卵巢大鼠抑郁樣行為可能與此運(yùn)動增強(qiáng)海馬組織抗炎癥能力、調(diào)節(jié)海馬CA1、CA3區(qū)的nNOS表達(dá)從而對去卵巢抑郁大鼠起到腦保護(hù)作用有關(guān)。具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。