月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測聯(lián)合IGRA對女性生殖器結(jié)核診斷價值

陳紅梅， 王 起， 方 喆， 黃移生， 蔣 源

(湖南省長沙市湖南省胸科醫(yī)院/湖南省結(jié)核病防治所院內(nèi)一科， 湖南 長沙 410006)

女性生殖器結(jié)核(FGT)是因結(jié)核桿菌感染所引起的女性生殖器疾病，該病常見于10～40歲女性，在絕經(jīng)后老年婦女也可見[1]。FGT多因肺結(jié)核、腸結(jié)核等其他臟器結(jié)核血行散播所引起，其中輸卵管結(jié)核占85%～90%，其次為子宮內(nèi)膜結(jié)核、卵巢結(jié)核，該病主要以發(fā)熱、盜汗、乏力、食欲不振、下腹墜痛為表現(xiàn)，缺乏特異性的臨床表現(xiàn)[2]。FGT與輸卵管性不孕、復發(fā)性流產(chǎn)等疾病具有較高的相關(guān)性，因此提高該病的診斷效率具有重要的意義[3]。目前對于該病的診斷除全身及婦科檢查外常以子宮內(nèi)膜病理檢查、輸卵管造影、活體組織檢查等方式進行，但上述診斷方法均可對患者造成一定的損傷，對于輸卵管和不明原因不孕及復發(fā)性流產(chǎn)患者早期結(jié)核桿菌篩查中適用性不高。月經(jīng)血結(jié)核桿菌熒光定量PCR(FQ-PCR)檢查取材過程無痛方便且被證實可用于FGT的診斷，但因取材等原因?qū)е略撛\斷方法有一定的漏檢率，因此本研究旨在通過分析月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測聯(lián)合γ-干擾素釋放試驗(IGRA)對FGT的診斷價值，以期為懷疑生殖器結(jié)核的輸卵管性及不明原因不孕、復發(fā)性流產(chǎn)患者結(jié)核桿菌篩查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2016年7月至2019年9月在湖南省胸科醫(yī)院(湖南省結(jié)核病防治所)就診的輸卵管性及不明原因不孕、復發(fā)性流產(chǎn)患者156例進行研究。納入標準：①行宮、腹腔鏡進行常規(guī)病因?qū)W檢查；②在檢查前未接受過抗結(jié)核治療；③患者神志清醒，智力正常，愿意配合相關(guān)檢查；④患者已獲知情同意。排除標準：①合并免疫系統(tǒng)疾病者；②既往已確診為FGT的疑似復發(fā)患者。③其他系統(tǒng)結(jié)核病患者。

1.2方法:對患者進行病因?qū)W檢查、月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測及IGRA檢測。①月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測：在月經(jīng)來潮1～3d，以窺陰器擴開陰道后采用無菌注射器吸取月經(jīng)血1～2mL進行FQ-PCR檢測，具體操作如下：1mL月經(jīng)血中加入10mL NH4Cl，渦旋混勻后靜置30min，以2500r/min轉(zhuǎn)速離心10min后取沉淀置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0μL沉淀加入40μLDNA提取液，吹打混勻后置100℃水浴10min進行DNA提取，水浴取出后室溫靜置1h，以13000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液10μL加入反應體系，按FQ-PCR試劑盒進行常規(guī)操作，≥50Copy則認為是陽性。DNA提取試劑盒購于德國默克公司，F(xiàn)Q-PCR試劑盒購于中山大學達安基因股份有限公司，采用美國伯樂公司生產(chǎn)的CFX96型FQ-PCR儀進行檢測。②IGRA：抽取患者空腹外周靜脈血4mL肝素抗凝后分離外周血單個核細胞，在微孔板陰性對照孔中加入50μL的細胞培養(yǎng)液，陽性對照孔則加入50μL植物血凝素，2個測試孔分別加以50μL的結(jié)核桿菌早期分泌抗原靶6ku蛋白(Early Seeretary Antigenic Target 6ku Protein，ESAT6)抗原(A抗原)及培養(yǎng)濾液蛋白10( Culture Filtrate Protein 10,CFP10)(B抗原)。在上述孔中分別加入稀釋后的外周血單個核細胞溶液100μL，按英國OxordImmunotec公司生產(chǎn)的試劑盒說明書進行孵育、洗滌、顯示等操作。結(jié)果判斷標準：當空白對照孔斑點數(shù)為0～5且A抗原或B抗原孔斑點數(shù)-孔板對照孔斑點數(shù)≥6；空白對照孔斑點數(shù)6～10個且A抗原或B抗原孔斑點數(shù)≥2倍孔板對照孔版點數(shù)則認為有反應性。若與上述情況不符且陽性質(zhì)控對照孔正常則認為是無反應性。③金標準：常規(guī)術(shù)前檢查無異常者在月經(jīng)干凈后3～7d住院，以腹腔鏡下對患者子宮、卵巢、輸卵管、盆腔情況進行檢查，對盆腔腹膜或臟器表面出現(xiàn)粟粒氧結(jié)節(jié)、干酪樣改變、盆腔廣泛黏連鈣化、輸卵管增粗僵硬等疑似病灶進行活檢送病理檢查，以鏡下表現(xiàn)及病理結(jié)果結(jié)合可確診為盆腔結(jié)核。內(nèi)膜結(jié)核者宮腔鏡下可見內(nèi)膜不均勻灰白色或干酪狀增生，血管豐富迂曲，嚴重者可見內(nèi)膜瘢痕化，宮腔黏連，將異常組織送病理檢查，見有典型結(jié)核結(jié)節(jié)即可診斷為內(nèi)膜結(jié)核。根據(jù)金標準診斷結(jié)果陽性者為病例組，陰性者為對照組。分析月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測聯(lián)合IGRA單獨檢測與聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核及內(nèi)膜結(jié)核的漏診率。漏診標準：病理檢查確診者未被檢出即為漏診，聯(lián)合檢測指2種檢測方式均未檢出病理檢查確診者即為漏診。

2 結(jié) 果

2.1一般情況:156例患者輸卵管性及不明原因不孕者共92例，經(jīng)腹腔鏡臨床及病理確診為生殖器結(jié)核21例(病例組)，對照組包括子宮內(nèi)膜異位5例，盆腔黏連49例，正常盆腔17例。復雜性流產(chǎn)患者64例，宮腔鏡臨床及病理確診為生殖器結(jié)核17例(病例組)，觀察組包括：慢性子宮內(nèi)膜炎36例，正常內(nèi)膜11例。兩組一般情況差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、2。

表1 不同組輸卵管性及不明原因不孕者一般情況比較

表2 不同組復雜性流產(chǎn)患者一般情況比較

2.2不同診斷方法對盆腔結(jié)核漏診率比較:聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核漏診率為14.29%，低于月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨檢測的42.86%與IGRA的52.38%(P<0.05)，見表3。

表3 不同診斷方法對盆腔結(jié)核漏診率比較(n=21)

2.3不同診斷方法對內(nèi)膜結(jié)核漏診率比較:聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核漏診率為11.76%，低于月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨檢測的35.29%與IGRA的52.94%(P<0.05)，見表4。

表4 月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測對FGT診斷效能分析(n=17)

3 討 論

近年隨著耐多藥結(jié)核桿菌及艾滋病的流行、抗生素及免疫抑制劑等藥物的濫用、器官移植增加等原因?qū)е陆Y(jié)核分枝桿菌感染性疾病的發(fā)生率明顯升高的趨勢[4]。結(jié)核分枝桿菌感染機體后，若得不到及時、有效的治療可致結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)大量繁殖并破壞入侵白細胞而引發(fā)結(jié)核病，除毛發(fā)、牙齒及指甲外，機體所有的組織器官均可受結(jié)核分枝桿菌的感染。臨床上以肺結(jié)核最為常見，肺外結(jié)核多結(jié)核分枝桿菌呼吸系統(tǒng)感染后經(jīng)肺部病變由血液或淋巴系統(tǒng)播散至全省各臟器，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示全球每年結(jié)核新發(fā)病例超過800萬，每年有140多萬人因結(jié)核病而死亡，F(xiàn)GT近年來發(fā)病率也有明顯上升的趨勢，約占肺外結(jié)核的11.9%[5]。FGT目前仍是發(fā)展中國家女性不孕及復發(fā)性流產(chǎn)的重要病因，結(jié)核桿菌感染生殖器官后可形成慢性炎癥，輸卵管為最早感染部位，其次為內(nèi)膜組織，因感染初期癥狀隱匿，常引起漏診與誤診，但隨著該病的疾病進展可經(jīng)腹腔鏡及宮腔鏡發(fā)現(xiàn)不可逆性的病變，對患者的生殖功能造成嚴重的影響[6]。因此FGT的早診斷、早治療對于保護患者的生育功能具有重要的意義。

FGT診斷金標準目前仍以病理學為主，病理學檢查在獲取組織樣本過程可對患者造成一定損傷，同時在疾病早期患者病變不明顯難以準確獲得組織樣本，因此目前尚無一種可完全診斷生殖器結(jié)核的方法，多需要結(jié)合患者病史、臨床表現(xiàn)并采用多種檢測手段以綜合診斷[7]。因此對于輸卵管性及不明原因不孕、復發(fā)性流產(chǎn)患者中可開展生殖器結(jié)核高?；颊叱醪胶Y查、病原學檢查及手術(shù)病理學診斷的階梯式診斷流程。目前臨床上對于病史、基礎體溫、子宮輸卵管造影結(jié)果提示FGT高危的患者進行病原學檢查，但傳統(tǒng)的培養(yǎng)、涂片鏡檢等病原學檢查方法檢測周期長，技術(shù)條件高，目前應用已較少。近年來隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)可通過快速擴增DNA而實現(xiàn)多種感染性疾病的快速診斷，尤其是FQ-PCR技術(shù)采用熒光標記探針的方法實現(xiàn)了定量功能且操作過程自動化程度較普通PCR更高，在減少勞動力的同時還可提高檢測的準確率，同時還可避免操作人員在使用傳統(tǒng)PCR電泳時接觸有毒有害試劑而保護操作人員的健康。國內(nèi)關(guān)于月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測用于診斷女性生殖器結(jié)核的研究已有相關(guān)報道[8]，該研究認為月經(jīng)血為子宮內(nèi)膜周期性脫落及子宮內(nèi)膜層血管所出的血，可有效反映子宮內(nèi)膜、輸卵管等女性生殖器官的生理及病理狀態(tài)，獲取月經(jīng)血這一特殊樣本過程方便無痛，相對于診斷性刮宮、腹腔鏡、宮腔鏡等有創(chuàng)診斷患者接受程度更高。有研究者曾對不孕癥患者取月經(jīng)血、子宮內(nèi)膜組織進行培養(yǎng)、抗酸染色及組織學檢查，結(jié)果顯示在結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性標本中月經(jīng)血占約70%，該研究認為月經(jīng)血結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性率高且無創(chuàng)，目前月經(jīng)血培養(yǎng)已成為FGT診斷的金標準之一，但該檢測方法對操作者經(jīng)驗要求較高，同時需要至少8周的時間進行檢查，不利于患者的早期診斷[9]。使用PCR診斷雖可縮短檢測時間，但漏診率較高，本研究結(jié)果顯示：本研究結(jié)果顯示：月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測對盆腔結(jié)核漏診率為42.86%，內(nèi)膜結(jié)核漏診率35.29%。可能與月經(jīng)血標本為血性標本，其中的血紅蛋白可抑制Taq酶活性，雖然在前處理過程已進行去除血紅蛋白的操作，但仍可引起一定的漏檢。再者月經(jīng)血中結(jié)核桿菌含量較低，月經(jīng)血取樣過程中為整體取樣，無法對疑似病灶進行特殊取樣使得其代表性受限，采取多次、多量取樣可能可提高診斷效能[10]。

IGRA主要利用ESAT-6抗原及CFP-10抗原刺激受試者外周血單個核細胞，再利用酶聯(lián)免疫斑點法對IFN-γ分泌細胞進行計數(shù)而診斷結(jié)核，該方法在2008年被美國FDA批準用于結(jié)核病的輔助診斷，近年來該方法被用于多種肺外結(jié)核患者的輔助診斷取得滿意的效果[11]，本研究結(jié)果顯示：聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核漏診率為14.29%，低于月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨檢測的42.86%與IGRA的52.38%(P<0.05)且聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核漏診率為11.76%，低于月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨檢測的35.29%與IGRA的52.94%(P<0.05)。IGRA檢測過程中不受卡介苗及其他肺結(jié)核分枝桿菌的影響，另外對于免疫低下或免疫抑制人群的患者結(jié)核桿菌感染T細胞檢測同樣適用，但該診斷方法無法同時預測結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展情況，同時該診斷方法無法確定結(jié)核桿菌感染部位，仍需結(jié)合其他相關(guān)檢查[12]。聯(lián)合診斷可彌補不同檢測方法的缺陷而提高臨床的確診率，但因IGRA對實驗室要求較高，檢測費用也相應升高，聯(lián)合診斷使患者的經(jīng)濟負擔明顯增加，臨床實踐過程中可根據(jù)患者意愿先采用月經(jīng)血FQ-PCR檢測，對于檢查陰性但結(jié)合臨床癥狀等其他手段分析疑似的患者可進行γ干擾素釋放試驗以提高診斷率，發(fā)揮不同診斷的優(yōu)勢而達到優(yōu)勢互補，使患者最大程度獲益[13]。

綜上所述，月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測及IGRA作為輸卵管性及不明原因不孕、復發(fā)性流產(chǎn)患者FGT早期篩查手段均存在一定的漏檢率，兩種診斷方式聯(lián)合檢測可有效降低漏檢率。雖然聯(lián)合診斷的方法可降低漏診率，但需要注意的是若出現(xiàn)月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測陰性但IGRA陽性時需結(jié)合病理等其他診斷方式才可進行最終確診。另外本研究為單中心研究，樣本量較少，指標有限，取得的結(jié)果可能出現(xiàn)一定的偏差，下一步將考慮進行多中心增加樣本量的研究以進一步證實本研究的觀點。