劉曉蕓,王雷斌,王 慶,張沙沙,趙微苗,賀 林,朱洪新

(上海交通大學(xué)Bio-X 研究院遺傳發(fā)育與精神神經(jīng)疾病教育部重點(diǎn)實驗室,上海 200240)

巨自噬(簡稱自噬)是真核細(xì)胞內(nèi)一種保守的溶酶體降解路徑,存在于體內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞中[1].自噬可人為地分為自噬起始、自噬體形成、自噬體成熟及溶酶體內(nèi)降解等幾個階段.目前,對自噬的分子機(jī)制已有了比較明確的認(rèn)識.在哺乳動物細(xì)胞自噬起始階段,ULK1-ATG13-FIP200 復(fù)合物中,ULK1 激活Beclin 1-VPS34-Atg14L 復(fù)合物組分VPS34,促進(jìn)PI3P 的合成,從而誘導(dǎo)自噬泡的形成.然后,細(xì)胞內(nèi)形成泛素樣復(fù)合物Atg12-Atg5-Atg16L,行使泛素連接酶的功能,促進(jìn)LC3-PE(也稱為LC3 Ⅱ)與自噬體外膜結(jié)合,并募集其他自噬體膜蛋白促進(jìn)自噬體形成.自噬體形成后與溶酶體外膜融合(自噬體成熟),自噬體內(nèi)膜及內(nèi)容物被溶酶體水解酶降解并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)加以再利用.自噬體成熟受Beclin 1-VPS34-UVRAG 復(fù)合物調(diào)控[2].因此,Beclin 1在細(xì)胞自噬起始及自噬體成熟階段起著關(guān)鍵作用.

Beclin 1 是哺乳動物的酵母Atg6 同源基因,也是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動物自噬相關(guān)基因[3].人Beclin 1 基因位于17q21,含12 個外顯子和11 個內(nèi)含子.Beclin 1 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為2 098 個堿基,包括120 個堿基的5′末端未翻譯區(qū),1 353 堿基的編碼區(qū)和625 個堿基的3′末端未翻譯區(qū)[4].在蛋白結(jié)構(gòu)上,Beclin 1有一個Bcl-2 同源結(jié)構(gòu)域3(Bcl-2 homology domain 3,BH3),一個coiled-coil 結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain,CCD)及一個進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(evolutionarily conserved domain,ECD).這些結(jié)構(gòu)域的存在使Beclin 1 可以與多個蛋白質(zhì)如VPS34 及UVRAG 形成復(fù)合物行使相應(yīng)的分子功能[5].

MEK5 是MEK 家族成員,由選擇性剪切產(chǎn)生MEK5α 和MEK5β,相應(yīng)合成的蛋白質(zhì)分別為50 和40 kDa[6].MEK5α 主要在腦和肝臟表達(dá),而MEK5β 在多種組織器官廣泛表達(dá)[6].已有研究表明,MEK5α 可結(jié)合并激活ERK5.MEK5α 也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠特異性激活ERK5 的上游激酶.而MEK5β 抑制MEK5α與ERK5 結(jié)合從而抑制MEK5α 激活ERK5.因此,MEK5α和MEK5β 對于ERK5 的激活具有拮抗作用[7].

目前,已有研究發(fā)現(xiàn)MAPK 家族信號通路如MEK-ERK 及JNK可調(diào)控Beclin 1 的表達(dá).而MEK5-ERK5 信號通路對Beclin 1 的表達(dá)調(diào)控尚不清楚[8-10].Beclin 1 在肌肉分化的過程中表達(dá)上調(diào),并調(diào)控心肌細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞分化[11-13].已有研究發(fā)現(xiàn),在肌肉分化過程中,MEK5-ERK5 信號通路活性增強(qiáng),并調(diào)控成肌細(xì)胞分化[14-16].本工作推測MEK5-ERK5 信號通路可能通過調(diào)控Beclin 1 基因表達(dá)從而調(diào)控肌肉分化,并主要研究MEK5 對于成肌細(xì)胞Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控.

1 材料與方法

1.1 試劑

PyrobestTMDNA Polymerase 及T4 DNA 連接酶購自Takara 公司.限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ及SalⅠ購自New England Biolabs(NEB)公司.1 kb plus DNA ladder 購自Invitrogen 公司.C2C12 細(xì)胞購自美國菌種保藏中心(American type culture collection,ATCC).胎牛血清及DMEM(高糖)購自Gibco 公司,Lipofectamine 2000 購自Invitrogen 公司.Dual Luciferase Reporter Assay System 購自Promega 公司.

1.2 質(zhì)粒

PCFG5-DD(持續(xù)活性 MEK5β),PCFG5-AA(負(fù)顯性 MEK5β)及 PCFG5-WT(野生 型MEK5β)由Stephan Ludwig 教授(Universitaetsklinikum Muenster)饋 贈.pCMVMEK5αCA(持續(xù)活性MEK5α)及pCMV-MEK5αDN(負(fù)顯性MEK5α)由Xia Zhengui 教授(University of Washington)饋贈.pS6(pCMV.SPORT6),pS6-CREB3,pS6-CREBP,pS6-CREBL1 及pS6-E2F-1 由馬鋼副教授及郭熙志教授(上海交通大學(xué))提供.

1.3 DNA 片段克隆與亞克隆

用SalⅠ和Hind Ⅲ雙酶切PCFG5-DD,將獲得的MEK5βDD 片段亞克隆至pDNA3.1(?)質(zhì)粒,得到pcDNA3.1-MEK5βDD(簡稱MEK5βDD),并進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定.用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增PCFG5-AA及PCFG5-WT中的MEK5β片段,將其亞克隆至pDNA3.1(?)質(zhì)粒,分別獲得pcDNA3.1-MEK5βAA(簡稱MEK5βAA)及pcDNA3.1-MEK5βWT(簡稱MEK5βWT).然后分別進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定.以鼠尾DNA 為模板,用PCR 擴(kuò)增Beclin 1 起始密碼子上游2 088 堿基對區(qū)域,并將其克隆至pGL3-Basic 載體KpnⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn),進(jìn)行酶切鑒定及測序鑒定.由于Beclin 1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游232 堿基對位置,因此將含有2 088 堿基對片段的pGL3-Basic 載體命名為p-1 856.類似地,以p-1 856 為模板,用PCR 分別擴(kuò)增起始密碼子上游1 870,1 613,1 448,1 207,1 023,586 及373 堿基對區(qū)域并克隆至pGL3-Basic 質(zhì)粒KpnⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn),分別獲得pGL3-Basic-1 638 (p-1 638),pGL3-Basic-1 381 (p-1 381),pGL3-Basic-1 216 (p-1 216),pGL3-Basic-975(p-975),pGL3-Basic-791(p-791),pGL3-Basic-354(p-354)及pGL3-Basic-141(p-141)載體,進(jìn)行酶切鑒定及測序鑒定后分析啟動子活性.不同長度Beclin 1 啟動子片段PCR 擴(kuò)增引物如表1所示.

表1 小鼠Beclin 1 啟動子片段PCR 擴(kuò)增引物Table 1 Sequences of primers used for PCR-amplification of mouse Beclin 1 promoter fragments

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液.將細(xì)胞接種至24 孔板,待次日細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時用lipofectamine 2000 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染操作按lipofectamine 2000 使用說明書進(jìn)行.如無特殊說明,0.8 μg 質(zhì)粒DNA 用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后24～48 h 進(jìn)行熒光素酶報告基因檢測實驗.

1.5 熒光素酶報告基因檢測

采用Promega 公司Dual Luciferase Reporter Assay System 進(jìn)行熒光素酶報告基因測定,具體操作按說明書進(jìn)行.

1.6 Real-time RT-PCR

使用TRIzol 試劑提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA,并將細(xì)胞總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(GENEray,GK8030-50)后用 real-time PCR(RT-PCR) 方法分析基因表達(dá)(GENEray,GK8020-200).用于real-time PCR 的Beclin 1 基因正向引物序列為5′-GCTCCTGTGGAATGGAATGA-3′,反向引物序列為5′-GAACAGTACAACGGCAACTC-3′;內(nèi)參基因Gapdh正向引物序列為5′-GTGTTCCTACCCCCAATGT-3′,反向引物序列為5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTC-3′.

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)均以mean±SD 表示,兩組間平均值比較采用student t 檢驗.多組間平均值比較采用單因素方差分析,P <0.05 表示差異具有顯著性.

2 結(jié)果

2.1 不同Beclin 1 啟動子片段的活性分析

為了確定Beclin 1 啟動子活性區(qū)域,首先將小鼠Beclin 1 起始密碼子上游2 088 堿基對區(qū)域克隆至pGL3-Basic 質(zhì)粒中(p-1 856).將p-1 856 或pGL3-Basic 轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞,雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示p-1 856 熒光素酶活性顯著增加(見圖1,圖中M 代表1 kb plus DNA ladder),表明Beclin 1 基因?1 856 區(qū)域具有啟動子活性.為了獲得Beclin 1 啟動子關(guān)鍵區(qū)域,將Beclin 1 啟動子?1 856 片段5′端刪除不同長度后亞克隆至pGL3-Basic,并進(jìn)行啟動子活性分析.實驗結(jié)果表明,p-354 熒光素酶活性最高,而p-791 熒光素酶活性顯著下降,p-141 熒光素酶活性最低(見圖1).上述結(jié)果表明,?354 ～?141 區(qū)域是Beclin 1 啟動子活性的關(guān)鍵區(qū)域.因此,接下來將使用p-354 進(jìn)一步研究Beclin 1 啟動子的調(diào)控.

圖1 小鼠Beclin 1 啟動子的克隆與活性分析Fig.1 Cloning and activity analysis of Beclin 1 promoters in mice

2.2 MEK5α 與MEK5β對Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控

為了研究 MEK5 對 Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控,首先將活性形式的MEK5α(MEK5αCA)或無活性形式的MEK5α(MEK5αDN)分別與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,MEK5αCA 顯著上調(diào)熒光素酶活性,而MEK5αDN 顯著下調(diào)熒光素酶活性(見圖2(a)),表明MEK5α能夠正向調(diào)控Beclin 1 啟動子活性.然后分別轉(zhuǎn)染不同量的MEK5αCA,結(jié)果表明少量MEK5αCA(0.3 μg)對Beclin 1啟動子活性無顯著作用,中量MEK5αCA(0.8 μg)可顯著上調(diào)Beclin 1 啟動子活性,而多量MEK5αCA(2.4 μg)可進(jìn)一步上調(diào)Beclin 1 啟動子活性(見圖2(b)).因此,MEK5αCA對于Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控具有劑量依賴關(guān)系.為了研究MEK5β對Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控,分別將活性MEK5β (MEK5βDD),野生型MEK5β(MEK5βWT)及無活性MEK5β(MEK5βAA)與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,盡管MEK5βAA 對p-354 活性無顯著影響,但MEK5βWT 及MEK5βDD 顯著下調(diào)Beclin 1 啟動子活性(見圖2(c)),表明MEK5β 負(fù)向調(diào)控Beclin 1 啟動子活性.為了揭示MEK5α 與MEK5β對Beclin 1 啟動子活性調(diào)控是否具有拮抗作用,將p-354,MEK5αCA 與MEK5βWT/MEK5βAA/MEK5βDD 分別共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染MEK5βDD 和MEK5αCA 導(dǎo)致p-354 的熒光素酶活性顯著降低(見圖2(d)),表明MEK5βDD 能夠抑制MEK5αCA對Beclin 1 啟動子活性的正向調(diào)控.

圖2 MEK5α 與MEK5β對Beclin 1 啟動子的調(diào)控Fig.2 MEK5α and MEK5β regulated Beclin 1 promoters

2.3 MEK5α 與MEK5β 調(diào)控Beclin 1 mRNA 表達(dá)

為了驗證MEK5α 與MEK5β 能夠調(diào)控細(xì)胞Beclin 1 基因表達(dá),將MEK5αCA 與MEK5βDD單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用real-time PCR 方法檢測Beclin 1 mRNA的表達(dá).由圖3可見,單獨(dú)轉(zhuǎn)染MEK5αCA 顯著上調(diào)Beclin 1 mRNA 表達(dá),單獨(dú)轉(zhuǎn)染MEK5βDD 顯著下調(diào)Beclin 1 mRNA 表達(dá).在MEK5βDD 與MEK5αCA 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,MEK5βDD 則顯著抑制MEK5αCA 對Beclin 1 mRNA 表達(dá)的促進(jìn)作用.這些結(jié)果說明MEK5α 與MEK5β分別正向和負(fù)向調(diào)控Beclin 1 mRNA表達(dá),二者具有拮抗作用,這與MEK5α 與MEK5β對Beclin 1 啟動子的調(diào)控結(jié)果一致.

圖3 MEK5α與MEK5β調(diào)控Beclin 1 mRNA 表達(dá)Fig.3 MEK5α and MEK5β regulated the expression of Beclin 1 mRNA

2.4 MEK5α 與CREB 對Beclin 1 啟動子活性調(diào)控具有協(xié)同效應(yīng)

在p-354 啟動子區(qū)域存在CREB 結(jié)合位點(diǎn),而MEK5-ERK5 信號通路能夠調(diào)控CREB 活性.因此,MEK5-ERK5 可能通過CREB 調(diào)控Beclin 1啟動子活性.首先研究CREB 是否能夠調(diào)控p-354 活性,將CREB 家族成員CREB3,CREBBP 及CREBL1 分別與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞,雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,CREB3,CREBBP 及CREBL1 均能夠顯著上調(diào)p-354 熒光素酶活性(見圖4(a)).將不同量的CREB3 與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞,雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染少量CREB3(0.3 μg)對p-354 熒光素酶活性無顯著影響,而轉(zhuǎn)染中量CREB3(0.8 μg)顯著上調(diào)p-354 熒光素酶活性,轉(zhuǎn)染多量CREB3(2.4 μg) 也顯著上調(diào)p-354 熒光素酶活性,但與轉(zhuǎn)染中量CREB3 無顯著差別(見圖4(b)),證明CREB 能夠上調(diào)Beclin 1 啟動子活性.接下來將少量CREB(0.3 μg)或MEK5αCA (0.3 μg)分別與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞,或者將少量CREB (0.3 μg)和MEK5αCA(0.3 μg)與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,單獨(dú)轉(zhuǎn)染少量CREB3,CREBP,CREBL1 或MEK5αCA 對p-354 熒光素酶活性無顯著影響,但共轉(zhuǎn)染少量CREB 和MEK5αCA 可顯著上調(diào)p-354 熒光素酶活性(見圖4(c)).上述結(jié)果表明MEK5α 與CREB 對Beclin 1 啟動子的調(diào)控具有協(xié)同效應(yīng).

圖4 MEK5α 與CREB對Beclin 1 啟動子調(diào)控的協(xié)同效應(yīng)Fig.4 Synergistic effects of MEK5α and CREB on Beclin 1 promoter

2.5 E2F-1 調(diào)控Beclin 1 啟動子活性

在p-1 381 與p-1 216 之間存在E2F-1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),因此選用長Beclin 1 啟動子區(qū)域p-1 856 研究E2F-1 對Beclin 1 啟動子的調(diào)控.將E2F-1 及p-1 856 共轉(zhuǎn)染至C2C12 細(xì)胞.雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示,E2F-1 顯著上調(diào)p-1 856 熒光素酶活性(見圖5),表明E2F-1 能夠調(diào)控Beclin 1 啟動子活性.MEK5 是否能夠通過E2F-1 調(diào)控Beclin 1 啟動子活性則有待進(jìn)一步研究.

圖5 E2F-1 促進(jìn)Beclin 1 啟動子活性Fig.5 E2F-1 facilitated Beclin 1 promoter activity

MEK5α 通過活化ERK5 促進(jìn)CREB 活性,進(jìn)而上調(diào)Beclin 1 基因表達(dá).MEK5β能夠抑制MEK5α 對ERK5 的激活從而抑制MEK5α 對Beclin 1 的表達(dá)調(diào)控.E2F-1 能促進(jìn)Beclin 1基因表達(dá).

3 討論

本工作主要發(fā)現(xiàn)如下:①Beclin 1 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游354 堿基對區(qū)域是Beclin 1 啟動子的關(guān)鍵活性區(qū)域;②MEK5α 和MEK5β 對Beclin 1 啟動子的調(diào)控具有相互拮抗作用;③CREB 促進(jìn)Beclin 1 啟動子活性,并與MEK5α 具有協(xié)同效應(yīng).

在Beclin 1 起始密碼子上游約2 kb 堿基對區(qū)域,Beclin 1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游354 堿基對區(qū)域具有最大啟動子活性,而轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游141 堿基對區(qū)域啟動子活性最低.因此,Beclin 1 啟動子活性的關(guān)鍵區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游354 堿基對區(qū)域與141 堿基對區(qū)域之間.Beclin 1 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游791 堿基對區(qū)域啟動子活性下降的原因可能是存在轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合位點(diǎn),這有待進(jìn)一步鑒定.Beclin 1 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 381 堿基對與1 216 堿基對之間區(qū)域存在E2F-1 結(jié)合位點(diǎn).E2F-1 能夠促進(jìn)Beclin 1 啟動子活性,這可能是?1 381 片段比?1 216 片段啟動子活性強(qiáng)的原因.

本工作發(fā)現(xiàn)MEK5α 和MEK5β 對Beclin 1 啟動子具有相反的調(diào)控作用,并且在mRNA水平上證實了MEK5α 和MEK5β對Beclin 1 表達(dá)的拮抗調(diào)控.已有研究中MEK5α能夠與ERK5 結(jié)合并激活ERK5,而MEK5β 抑制MEK5α與ERK5 結(jié)合從而抑制MEK5α 誘導(dǎo)的ERK5 活化[7].因此,可認(rèn)為MEK5α 通過活化ERK5 上調(diào)Beclin 1 基因表達(dá).MEK5β 能夠抑制MEK5α 對ERK5 的激活從而抑制MEK5α 對Beclin 1 的表達(dá)調(diào)控(見圖6).鑒于?354 堿基對區(qū)域Beclin 1 啟動子片段活性最強(qiáng),?141 堿基對區(qū)域Beclin 1 啟動子片段活性最弱,而CREB 結(jié)合位點(diǎn)位于?354 堿基對區(qū)域與?141 堿基對區(qū)域之間,并能劑量依賴性調(diào)控Beclin 1 啟動子活性,這提示CREB 可能是調(diào)控Beclin 1 表達(dá)的關(guān)鍵因子.本工作發(fā)現(xiàn)MEK5α 與CREB 對Beclin 1 啟動子活化具有協(xié)同效應(yīng),這與文獻(xiàn)[17]發(fā)現(xiàn)的MEK5-ERK5信號通路能夠活化CREB 一致.因此,CREB 可能是MEK5-ERK5 信號通路調(diào)控Beclin 1表達(dá)的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子.此外,本工作還發(fā)現(xiàn)E2F-1 能夠促進(jìn)Beclin 1 啟動子活性,這與Weinmann 等[18]的報道一致.目前尚不清楚MEK5α 和MEK5β 是否可以直接調(diào)控E2F-1的活性.但已有報道表明CREB 能夠上調(diào)E2F-1 的表達(dá)[19],因此MEK5-ERK5 有可能通過CREB 間接調(diào)控E2F-1 的活性,從而調(diào)控Beclin 1 基因表達(dá).

圖6 MEK5 調(diào)控Beclin 1 基因表達(dá)模式Fig.6 Pattern of MEK5 regulating Beclin 1 expression

Beclin 1 在生物體內(nèi)廣泛表達(dá),能夠調(diào)控多種生物學(xué)過程如細(xì)胞自噬、增殖、分化和凋亡[20].本工作使用小鼠成肌細(xì)胞C2C12 研究了MEK5 對Beclin 1 啟動子活性的調(diào)控.Beclin 1 在肌肉細(xì)胞分化過程中表達(dá)增加,自噬上調(diào)[11-13].因此,本工作對于肌肉細(xì)胞分化調(diào)控研究具有一定意義,也對Beclin 1 調(diào)控其他生物學(xué)過程的研究具有一定的啟示.此外,Beclin 1 在多種疾病如腫瘤、心臟疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中均起著重要作用[21-23],因此本工作對于與Beclin 1 相關(guān)的疾病研究也具有一定意義.