陳 蘢，楊 俊，馬毛毛，吳莎莎，余 平,3，曾哲靈,3,*

（1.南昌大學食品學院，江西 南昌 330031；2.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；3.南昌大學資源環(huán)境與化工學院，江西 南昌 330031）

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)氨基酸基團之間的肽鍵的酶，是構(gòu)成重要的工業(yè)酶類之一。目前，工業(yè)酶的全球銷售額估計為42億 美元[1-2]，而蛋白水解酶約占60%。蛋白酶常用于洗滌劑、食品蛋白質(zhì)、釀造、肉類、皮革和乳制品行業(yè)[3-6]，為提高營養(yǎng)價值、消化率、適口性、風味和減少變應原性化合物，處理生活垃圾和工業(yè)廢物，以及參與蛋白質(zhì)的合成和結(jié)構(gòu)解析作出了重要貢獻[7]。蛋白酶廣泛存在于各種微生物、動物和植物中[8]，由于微生物具有快速生長、生長所需的空間小以及易于遺傳操作等經(jīng)濟和技術(shù)優(yōu)勢，是目前工業(yè)蛋白酶的主要來源。一些產(chǎn)蛋白酶的微生物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如真菌類中的霉菌及酵母菌[9-11]等，細菌中的枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis）[12]，鹽單胞菌屬（Halomonas）[13]等。近年來，世界各地對蛋白酶的需求呈現(xiàn)上升的趨勢，人們愈發(fā)關(guān)注高產(chǎn)蛋白酶菌株的研究[14]。鄧維琴等[15]從豆瓣醬中篩選出17 株高產(chǎn)蛋白酶菌株。王慶齡[16]從南極磷蝦中篩選出低溫下高產(chǎn)蛋白酶菌株。如何獲得新的高產(chǎn)蛋白酶菌株，越來越成為當前研究的熱點。

蛋白酶生產(chǎn)原料成本約占總成本的40%。傳統(tǒng)方法一般以豆粕作為發(fā)酵原料以生產(chǎn)蛋白酶，但是隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，大量豆粕被用作飼料，無法滿足酶工業(yè)需求，因此，尋找價格低廉、營養(yǎng)價值高的蛋白酶原料迫在眉睫[17]。我國油菜籽產(chǎn)量居世界首位，占全球油菜籽產(chǎn)量的21.14%[18-19]，菜籽粕作為這種油料作物的低廉廢料，其蛋白質(zhì)含量較高，為干物質(zhì)的33.9%～36%，因此，具有作為發(fā)酵原料產(chǎn)蛋白酶的潛力。此外，蛋白酶的微生物合成受到多種因素的影響，例如溫度、pH值、碳源、氮源、發(fā)酵時間和發(fā)酵類型[20]，其中碳源和氮源的類型及其濃度的合理使用對酶生產(chǎn)成本的降低起到至關(guān)重要的作用。因此，優(yōu)化工藝條件是酶生產(chǎn)過程中非常必要的一步。

本實驗從食堂污水中篩選出1 株高產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌CL-10，將其作為出發(fā)菌，以菜籽粕作為發(fā)酵的氮源，以單因素試驗和響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基組成，以期為蛋白酶生產(chǎn)成本的降低和菜籽粕的資源化利用提供理論和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與試劑

樣品來源：南昌大學食堂污水。

酪氨酸標準樣品、福林-酚、脫脂奶粉 北京索萊寶生物科技有限公司；DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；干酪素 天津市大茂化學試劑廠；蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；菜籽粕、花生粕、豆粕、芝麻粕 南昌市農(nóng)貿(mào)市場；MgSO4、CaCl2、NaCl2、葡萄糖、硫酸銨、表面活性劑、無水碳酸鈉等無機鹽離子 西隴科學股份有限公司。所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，脫脂牛奶1.5%，脫脂牛奶單獨滅菌在110 ℃滅菌15 min；LB培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基）：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化鈉1%；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕4%，玉米粉3%，麩皮3%，KH2PO40.03%，Na2HPO4g 12H2O 0.4%，pH值為自然。以上培養(yǎng)基在121 ℃滅菌鍋滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；TU-1950紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；ST 16R低溫高速離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XSZ-4G型中級生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；JSM 6701F型場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)

參考肖彥駿等[21]關(guān)于培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)的方法并適當修改。用接種環(huán)取斜面保存的菌株2 環(huán)，接入裝有25 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)12 h進行活化作為種子液。將活化好的菌液按4%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心取上清發(fā)酵液，測定蛋白酶活力。

1.3.2 菌種篩選

初篩：取食堂污水樣品用梯度稀釋法稀釋適當倍數(shù)，將稀釋的樣品涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，平板在37 ℃培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取有明顯水解圈的菌株劃線挑取單菌落，用游標卡尺測量水解圈和菌落直徑，選取水解圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株作為初篩的產(chǎn)蛋白酶菌株。

復篩：將初篩篩選的比值較大的菌株接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵48 h后離心取上清液，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力，選取酶活力最高的菌株命名為CL-10。

1.3.3 菌株的鑒定

參照文獻[22]通過菌株形態(tài)觀察、掃描電鏡、各種生理生化實驗和16S rRNA測序鑒定產(chǎn)生蛋白酶的菌株。使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，參照權(quán)淑靜等[23]的方法擴增菌株16S rDNA，將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海美吉生物測序。通過GenBank數(shù)據(jù)做相似性分析，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 蛋白酶活力測定和平均氮源成本

按照GB/T 23527ü 2009《蛋白酶制劑》[24]，采用福林-酚法測定中性蛋白酶活力。酶活力單位定義：1 mL液體酶在40 ℃、pH 7.5條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為一個酶活力單位，以U/mL表示。

平均氮源成本=氮源消耗質(zhì)量×氮源單價/單位酶活力×發(fā)酵總體積；菜籽粕單價=0.66豆粕單價=0.49花生粕單價=0.58芝麻粕單價。

1.3.5 單因素試驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分

1.3.5.1 氮源種類和含量對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆粕分別用4%的菜籽粕、花生粕、芝麻粕、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨替換，進行發(fā)酵培養(yǎng)，以發(fā)酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳氮源種類。將選擇出的氮源質(zhì)量分數(shù)分別設(shè)為3%、4%、5%、6%、7%、8%，以發(fā)酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳氮源含量。

1.3.5.2 碳源種類和含量對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用3%麥芽糖、甘油、淀粉、葡萄糖、乳糖、糊精、玉米粉替換，進行發(fā)酵培養(yǎng)，以發(fā)酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳碳源種類。將選擇出的碳源質(zhì)量分數(shù)分別設(shè)為1%、2%、3%、4%、5%、6%，以發(fā)酵液上清中蛋白酶活力為指標，確定最佳碳源含量。

1.3.5.3 麩皮質(zhì)量分數(shù)對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的麩皮質(zhì)量分數(shù)設(shè)為1%、2%、3%、4%、5%、6%，進行發(fā)酵培養(yǎng)，以發(fā)酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳麩皮質(zhì)量分數(shù)。

1.3.5.4 表面活性劑種類和體積分數(shù)對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上添加表面活性劑進行發(fā)酵培養(yǎng)，表面活性劑分別為體積分數(shù)0.4%的吐溫20、吐溫60、吐溫80、曲拉通X-100，以發(fā)酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳表面活性劑種類。將選擇出的表面活性劑體積分數(shù)分別設(shè)為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%，以發(fā)酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳表面活性劑濃度。

1.3.5.5 金屬離子種類和質(zhì)量分數(shù)對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上添加金屬離子進行發(fā)酵培養(yǎng)，金屬離子分別為質(zhì)量分數(shù)0.1%的Fe2(SO4)3、MgSO4、ZnSO4g 7H2O、CaCl2、CuSO4、MnCl2g 4H2O、Al(NO3)3g 9H2O，以發(fā)酵液上清中蛋白酶活力為指標，確定最佳金屬離子種類。將選擇出的金屬離子鹽質(zhì)量分數(shù)分別設(shè)為0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%，以發(fā)酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳金屬離子質(zhì)量分數(shù)。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基響應面試驗優(yōu)化

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，確定對發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶最具影響的3 個因素菜籽粕質(zhì)量分數(shù)（A）、玉米粉質(zhì)量分數(shù)（B）、麩皮質(zhì)量分數(shù)（C），以蛋白酶活力（Y）作為響應值，采用Design-Expert 10.0.1軟件，應用Box-Behnken方法設(shè)計試驗組合，優(yōu)化和驗證產(chǎn)酶最佳發(fā)酵條件，因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

經(jīng)過初篩和復篩，篩選出1 株基礎(chǔ)產(chǎn)蛋白酶活力為2 715 U/mL的菌株，并命名為CL-10，參照文獻[22]，對菌株CL-10進行生理生化鑒定實驗。如圖1所示，該菌株水解圈與菌落直徑比較大，菌體呈短桿狀。由表2可知，菌株CL-10為芽孢桿菌屬。由圖2可知，菌株CL-10與解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）MPA1034在同一分支，序列相似性為100%。綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特性、16S rDNA序列以及系統(tǒng)進化樹的結(jié)果，可以將分離菌株CL-10鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 菌株CL-10蛋白酶水解圈形態(tài)（A）和掃描電鏡形態(tài)（B）Fig.1 Proteolytic circles (A) formed by strain CL-10 and scanning electron microscope morphology (B)

表2 菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification of the strain

圖2 菌株CL-10 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain CL-10 based on 16S rDNA sequence

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的確定

2.2.1 氮源對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

從圖3a可知，不同氮源對產(chǎn)酶影響有較大差異，有機氮源比無機氮源更有利于發(fā)酵產(chǎn)酶。其中，以成本最低的菜籽粕作為氮源時，酶活力最大，達到3 891.5 U/mL，與以豆粕作為氮源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比，酶活力提高了43.3%，平均氮源成本低。菜籽粕中蛋氨酸和賴氨酸等氨基酸成分的含量較高[25]，鈣、磷、硒、錳礦物質(zhì)含量高，這些氨基酸和礦物質(zhì)對解淀粉芽孢桿菌的生長和產(chǎn)酶有明顯的促進作用，這可能是菜籽粕作為氮源大大促進解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的原因。進一步優(yōu)化得菜籽粕質(zhì)量分數(shù)為6%時（圖3b），蛋白酶活力最高為4 339.7 U/mL，因此選擇6%的菜籽粕作為優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

圖3 氮源種類（a）和菜籽粕質(zhì)量分數(shù)（b）對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.3 Effects of nitrogen source (a) and rapeseed meal (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

2.2.2 碳源對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

圖4 碳源種類（a）和玉米粉質(zhì)量分數(shù)（b）對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.4 Effects of carbon source (a) and corn flour (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

從圖4a可以看出，當玉米粉作為碳源時蛋白酶活力最高，其余依次為葡萄糖、糊精、淀粉、甘油、乳糖、麥芽糖，這可能是因為玉米粉中含有多種微生物需要的營養(yǎng)成分，能促進蛋白酶的生成。當玉米粉質(zhì)量分數(shù)為4%時有最高酶活力4 409 U/mL（圖4b）。解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)酶需要足夠的碳源，濃度較低導致微生物營養(yǎng)不充分，影響生長代謝，進而影響產(chǎn)酶，但玉米粉濃度過高培養(yǎng)基較黏稠，不利于代謝進而抑制產(chǎn)酶。因此選擇4%的玉米粉粕作為優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。

2.2.3 麩皮質(zhì)量分數(shù)對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

圖5 麩皮質(zhì)量分數(shù)對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.5 Effect of wheat bran on protease production by B.amyloliquefaciens

麩皮中含有較多的維生素及微量元素，在微生物發(fā)酵過程中常被用作生長因子添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。由圖5可知，在1%～3%之間，隨著麩皮質(zhì)量分數(shù)的增加，酶活力逐漸增加，在3%達到產(chǎn)酶最大值4 422.4 U/mL，大于3%酶活力逐漸減少。因此選擇優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的麩皮質(zhì)量分數(shù)為3%。

2.2.4 表面活性劑對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

圖6 表面活性劑（a）和吐溫20體積分數(shù)（b）對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.6 Effects of surfactant type (a) and Tween 20 (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

由圖6a可知，表面活性劑吐溫80、吐溫60對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶有輕微的抑制效果，曲拉通的抑制效果最明顯，相反，表面活性劑吐溫20對發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶有促進效果。相對于對照組，添加吐溫20酶活力提高了6.8%，是因為吐溫20作為一種非離子型表面活性劑，可以增大細胞膜的滲透性，減少酶在細胞膜上的吸附量，細胞內(nèi)的酶更容易透過細胞膜而分泌出來[26-27]。在吐溫20體積分數(shù)為0.7%時達到最大值5 156.7 U/mL（圖6b），因此選擇優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中表面活性劑為吐溫20且體積分數(shù)為0.7%。

2.2.5 金屬離子對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

圖7 金屬離子種類（a）和ZnSO4g 7H2O質(zhì)量分數(shù)（b）對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.7 Effects of metal ions (a) and ZnSO4·7H2O concentration (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

研究發(fā)現(xiàn)，添加少量的金屬離子對蛋白酶活性有顯著提高[28]。由圖7a可知，對酶活力影響最大的是ZnSO4g 7H2O，提高了10.2%，這是因為部分中性蛋白酶活性部位不含Zn2+，額外加入的Zn2+能通過疏水鍵結(jié)合、金屬結(jié)合和離子相互作用等方式提高中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性[29]。因此，出于發(fā)酵培養(yǎng)基簡單原則，選擇添加ZnSO4g 7H2O。ZnSO4g 7H2O質(zhì)量分數(shù)在0.2%達到最大值5 841.3 U/mL（圖7b），隨著ZnSO4g 7H2O質(zhì)量分數(shù)增加，酶活力逐漸降低，這是因為離子濃度過高對微生物產(chǎn)酶產(chǎn)生抑制作用。因此選擇添加ZnSO4g 7H2O且質(zhì)量分數(shù)為0.2%。

2.3 響應面設(shè)計結(jié)果與分析

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗

以菜籽粕質(zhì)量分數(shù)（A）、玉米粉質(zhì)量分數(shù)（B）、麩皮質(zhì)量分數(shù)（C）為響應面試驗的3 個因素，以蛋白酶活力（Y）為響應值，通過3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計和響應面分析方法，確定解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)蛋白酶最佳工藝條件，結(jié)果見表3。應用Design-Expert 10.0.1軟件進行多元回歸擬合分析，各試驗因素對響應值的綜合影響可用如下多元二次回歸方程表示：Y=6 409.58+88.18A+140.90B+237.33C-37.85AB-2.50AC-252.20BC-290.82A2-113.87B2-354.31C2。

表3 響應面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and experimental results for response surface analysis

表4 響應面分析試驗方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

如表4所示，整體模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.106 7），說明該回歸方程可真實反映自變量和因變量的關(guān)系，模型中的R2為97.8%，調(diào)整后為95%，說明95%的響應值變化可以通過模型進行解釋，因此可以用此模型進行分析和預測。

2.3.2 各因素交互作用分析

圖8 各因素交互作用對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of rapeseed meal, corn flour and wheat bran levels on protease production by B.amyloliquefaciens

由圖8可以看出，蛋白酶活力隨著菜籽粕質(zhì)量分數(shù)、玉米粉質(zhì)量分數(shù)、麩皮質(zhì)量分數(shù)的變化出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中BC交互作用為極顯著，AB和AC為不顯著。通過優(yōu)化得到解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的最佳工藝參數(shù)為菜籽粕質(zhì)量分數(shù)6.125%、玉米粉質(zhì)量分數(shù)4.375%、麩皮質(zhì)量分數(shù)3.199%，該條件下的蛋白酶活力預測值為6 465.4 U/mL。根據(jù)實際稱量的方便將工藝參數(shù)調(diào)整菜籽粕質(zhì)量分數(shù)6.1%、玉米粉質(zhì)量分數(shù)4.4%、麩皮質(zhì)量分數(shù)3.2%，在此條件下進行3 組平行驗證實驗，得到蛋白酶活力平均值為6 385.1 U/mL，平均氮源成本降低了54.6%。實際值與預測值有很好的擬合性，進而驗證了模型的有效性。相比較于耿芳等[30]從土壤中篩選的產(chǎn)蛋白酶活力1 932.3 U/mL的黏質(zhì)沙雷氏菌，Zeng Cheng等[31]篩選的產(chǎn)酶為4 536.5 U/mL的解淀粉芽孢桿菌，游玟娟等[32]篩選的產(chǎn)酶2 665.2 U/mL的枯草芽孢桿菌，本實驗篩選的菌株優(yōu)勢明顯。此外，溫擁軍等[33]和于新穎[34]同樣通過發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)蛋白酶，結(jié)果分別為2 602.7 U/mL和1 959.82 U/mL，亦低于本研究的結(jié)果。因此，本研究篩選的菌株和發(fā)酵條件，可高效生產(chǎn)蛋白酶。

3 結(jié) 論

本研究篩選出1 株高產(chǎn)蛋白酶的菌株，通過形態(tài)學觀察，生理生化實驗和16S rDNA測序鑒定為解淀粉芽孢桿菌CL-10。以此為出發(fā)菌，通過單因素試驗和響應面優(yōu)化培養(yǎng)基成分，探究出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件為：菜籽粕質(zhì)量分數(shù)6.1%、玉米粉質(zhì)量分數(shù)4.4%、麩皮質(zhì)量分數(shù)3.2%、ZnSO4g 7H2O質(zhì)量分數(shù)0.2%、吐溫20體積分數(shù)0.7%。相較于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在最優(yōu)條件下，酶活力從2 715 U/mL提高到6 385.1 U/mL，平均氮源成本降低了54.6%。本實驗用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)蛋白酶，具有酶活力高、成本低、工藝簡單的特點，可以作為蛋白酶工藝優(yōu)化和菜籽粕的資源化利用的方法。但是現(xiàn)階段該菌的酶活相對于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株還有距離，期待后期通過進一步優(yōu)化及誘變得到可以進行工業(yè)化生產(chǎn)的菌株。