恢刺“陽(yáng)陵泉”穴對(duì)腦卒中大鼠肌痙攣狀態(tài)和腦梗死體積的影響*

孫天祎,馬良宵,王俊翔,母杰丹,錢(qián) 旭,于文顏,宋 越,甘瑩瑩,田 園

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

腦卒中后出現(xiàn)痙攣狀態(tài)，意味著以大腦為代表的上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在受到損傷后，失去了其對(duì)下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的調(diào)控能力，使原本被抑制的反射得到釋放，最終導(dǎo)致肌痙攣現(xiàn)象的發(fā)生[1]。肌痙攣是腦卒中患者常見(jiàn)并發(fā)癥，也是運(yùn)動(dòng)功能障礙的重要原因之一[2]。因此，大腦損傷、肌痙攣和運(yùn)動(dòng)功能障礙三者之間關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死體積比例較小的大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分較低，其痙攣程度和運(yùn)動(dòng)障礙也相對(duì)較輕[3]。由此可見(jiàn)，腦缺血狀態(tài)的改善對(duì)于緩解肌痙攣具有重要意義，二者之間存在的關(guān)聯(lián)可以通過(guò)觀察腦梗死體積比、Zea Longa神經(jīng)功能損傷評(píng)分、改良Ashworth評(píng)分(Modified ashworth scale,MAS)和網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)來(lái)探尋。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療卒中后痙攣的方法主要包括外科手術(shù)、藥物治療與肌內(nèi)效貼治療等[4]，但其潛在的手術(shù)并發(fā)癥、毒性反應(yīng)和皮膚過(guò)敏反應(yīng)等副作用不容忽視。針刺治療卒中后痙攣安全有效[5-6]，機(jī)制研究顯示針刺可增加缺血性卒中患者的腦血流量[7]，降低大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型大鼠的腦梗死體積比，對(duì)腦組織起保護(hù)作用[8]。運(yùn)動(dòng)類(lèi)刺法強(qiáng)調(diào)針刺和運(yùn)動(dòng)的有效結(jié)合，是治療痙攣的有效手段[9]。恢刺是《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載的主治筋肉拘攣的經(jīng)典刺法，也是運(yùn)動(dòng)類(lèi)刺法的始源，在緩解中風(fēng)后患者肌痙攣程度、改善患者運(yùn)動(dòng)功能和提高痙攣治愈率等方面發(fā)揮了重要作用[10-13]。

本研究借助成熟的卒中后痙攣大鼠模型為研究平臺(tái)，觀察恢刺“陽(yáng)陵泉”穴對(duì)模型大鼠腦梗死體積、肌痙攣狀態(tài)及運(yùn)動(dòng)功能的影響，初步揭示恢刺法的抗痙攣及神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床制定卒中后痙攣的最佳刺法方案提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年SPF級(jí)雄性SD大鼠，45只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)買(mǎi)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。自然晝夜，自由進(jìn)食水。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將45只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(9只)、模型組(18只)和恢刺組(18只)。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理審查中心審批(批準(zhǔn)號(hào)：BUCM-4-2019062701-2048)，對(duì)所有動(dòng)物的操作處理均符合北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2 主要儀器和試劑

0.3%2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液(AMRESCO，美國(guó))；尼龍線栓(0.36±0.02 mm in diameter, 45 mm in length, 北京沙東生物科技有限公司, 北京);中研太和牌針灸針(0.25 mm×13 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，北京);網(wǎng)屏裝置(北京智鼠多寶生物科技有限公司，北京)；ImageJ圖像分析軟件(1.52q，National Institutes of Health，美國(guó))。

1.3 模型制備

采用改進(jìn)的線栓法制作卒中后痙攣模型[14-15]。大鼠手術(shù)前12 h禁食不禁水，稱(chēng)重后用1%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥位固定、備皮和消毒，于頸部正中稍偏右行縱向切口約1.5 cm，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，并依次鈍性分離迷走神經(jīng)、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，用手術(shù)線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，并用動(dòng)脈夾夾閉頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。在距離頸總動(dòng)脈分叉處5 mm左右處行切口，將尼龍線栓經(jīng)切口緩慢插入，松開(kāi)夾于頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，將線栓繼續(xù)插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至稍感阻力，此時(shí)線栓插入深度為18～20 mm左右。松開(kāi)夾于頸外動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，再在切口遠(yuǎn)心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈以固定線栓，清洗補(bǔ)液后進(jìn)行分層縫合，最后用青霉素粉末敷于傷口預(yù)防感染。術(shù)后在傷口處用青霉素進(jìn)行濕敷，并在腹股溝與腹白線之間行腹腔注射青霉素20 U/d，連續(xù)3 d。假手術(shù)組除不結(jié)扎頸總動(dòng)脈和不插入線栓外，其余步驟與模型組制作相同。

1.4 模型評(píng)價(jià)

1.4.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分 采用Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)定模型大鼠的神經(jīng)功能損傷情況。0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪或后爪；2分，行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.4.2 痙攣程度評(píng)價(jià) 以改良Ashworth評(píng)分(MAS)[16]為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定模型大鼠痙攣程度。根據(jù)肢體被動(dòng)活動(dòng)及關(guān)節(jié)屈伸的自由程度分為6級(jí)：0級(jí):無(wú)肌張力增高，大鼠活動(dòng)自如；1級(jí):輕度肌張力增高，受累部位被動(dòng)屈伸至ROM末(肌肉接近最長(zhǎng)距離時(shí))有輕度阻力或一過(guò)性停頓；1+級(jí)，輕度肌張力增高，被動(dòng)屈伸至ROM后50%范圍內(nèi)(肌肉在偏長(zhǎng)的位置時(shí))出現(xiàn)一過(guò)性停頓，繼續(xù)進(jìn)行始終有輕度阻力；2級(jí):明顯肌張力增高，但肢體尚易屈伸，有輕度共濟(jì)失調(diào)；3級(jí):明顯肌張力增高，被動(dòng)活動(dòng)困難，有中度共濟(jì)失調(diào)；4級(jí):肢體屈伸受限，有重度共濟(jì)失調(diào)。

1.4.3 模型成功標(biāo)準(zhǔn) 大鼠術(shù)后第3天(治療前)Zea Longa評(píng)分1～3分且MAS評(píng)分1級(jí)及以上為卒中后痙攣模型成功標(biāo)準(zhǔn)[17]。

1.5 干預(yù)時(shí)機(jī)及方法

研究[15]顯示，模型大鼠的神經(jīng)功能損傷于術(shù)后第3天到達(dá)高峰，肌張力于術(shù)后第6天和第9天到達(dá)高峰，并且二者均從術(shù)后第10天開(kāi)始逐漸減輕。課題組前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第3～9天內(nèi)，大鼠痙攣狀態(tài)穩(wěn)定，與上述研究的結(jié)果相符。因此，為盡可能地減少大鼠自身恢復(fù)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，干預(yù)在術(shù)后第3天開(kāi)始，在術(shù)后第9天結(jié)束。

取穴：大鼠“陽(yáng)陵泉”穴位于腓骨頭前下方凹陷處[19]。針刺方法：恢刺組以毫針先直刺入大鼠“陽(yáng)陵泉”穴4～5 mm，再將針退至皮下，向左右方向提插30 s，提針至皮下，持續(xù)、緩慢活動(dòng)踝關(guān)節(jié)30 s，再將針刺入穴位4～5 mm處留針30 min。假手術(shù)組和模型組術(shù)后不做治療處理，但進(jìn)行與恢刺組相同程度與時(shí)間的捉抓、束縛刺激。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 Zea Longa神經(jīng)功能損傷評(píng)分 于造模前、治療前(術(shù)后3 d)和治療后(術(shù)后9 d)對(duì)大鼠進(jìn)行測(cè)評(píng)，以評(píng)定大鼠的神經(jīng)功能損傷恢復(fù)情況。

1.6.2 MAS肌張力評(píng)分 于造模前、治療前(術(shù)后3 d)、治療后(術(shù)后9 d)進(jìn)行測(cè)評(píng)，以評(píng)定大鼠的痙攣程度。

1.6.3 網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 于造模前、術(shù)后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d和9 d行網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)[3]，以評(píng)定大鼠肌力、肌張力及平衡能力等綜合運(yùn)動(dòng)功能。把大鼠置于水平網(wǎng)面上，在2 s內(nèi)將網(wǎng)屏緩慢翻轉(zhuǎn)90°至垂直狀態(tài)并維持5 s，觀察大鼠停留的時(shí)間。5分:大鼠能夠牢牢鎖住網(wǎng)屏裝置且能夠向上爬；4分:大鼠四肢能鎖住網(wǎng)線并留在網(wǎng)上5 s；3分:能暫時(shí)鎖住網(wǎng)線但會(huì)滑落一定距離；2分:5 s以內(nèi)掉落；1分:網(wǎng)屏垂直時(shí)即刻掉落。

1.6.4 TTC染色觀察大鼠腦梗死體積 治療結(jié)束后，每組隨機(jī)選取4只大鼠，稱(chēng)重后用1%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔注射，深度麻醉后斷頭取腦，迅速放入-20 ℃冰箱冷凍約20 min。凍好后取出腦組織，將嗅球、小腦和腦干完全切除，并沿冠狀面切割腦組織，間隔2 mm，共6片，將其立即置于0.3%TTC磷酸鹽緩沖液中，37 ℃恒溫水浴避光孵育20 min，每5 min翻動(dòng)1次。染色均勻后置于4%多聚甲醛中避光固定24 h，將每組腦切片排列整齊并拍照。采用ImageJ圖像分析軟件計(jì)算每只大鼠腦梗死體積百分比(各切片白色缺血區(qū)體積之和/各切片腦片體積之和×100%)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

假手術(shù)組9只大鼠健康狀態(tài)良好，沒(méi)有死亡；模型組大鼠4只死亡，6只未表現(xiàn)出痙攣，最終納入8只；恢刺組大鼠5只死亡，4只未表現(xiàn)出痙攣，最終納入9只。

2.1 各組大鼠Zea Longa神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較

造模前各組大鼠、術(shù)后假手術(shù)組大鼠均未出現(xiàn)任何神經(jīng)功能損傷癥狀，Zea Longa評(píng)分為0。治療前，與假手術(shù)組相比，模型組與恢刺組Zea Longa評(píng)分均顯著升高(P<0.01)；模型組與恢刺組的Zea Longa評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，與模型組比較，恢刺組Zea Longa評(píng)分顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠治療前后Zea Longa神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較

2.2 各組大鼠MAS肌張力分級(jí)評(píng)分比較

造模前各組大鼠、術(shù)后假手術(shù)組大鼠肌張力均正常，MAS評(píng)級(jí)均為0級(jí)。治療前，與假手術(shù)組相比，模型組和恢刺組MAS分級(jí)評(píng)分均顯著升高(P<0.01)；模型組與恢刺組的MAS分級(jí)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，與模型組比較，恢刺組MAS分級(jí)評(píng)分顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠治療前后改良Ashworth分級(jí)評(píng)分(MAS)比較

2.3 各組大鼠網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較

造模前各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能均正常，網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分均為5分。造模后，與假手術(shù)組比較，模型組和恢刺組在術(shù)后2 h網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分均明顯下降(P<0.01)。治療后(術(shù)后9 d)，與模型組比較，恢刺組的網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分明顯升高(P<0.01)。隨著治療次數(shù)的增加，恢刺組的網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分逐漸上升的趨勢(shì)明顯，治療結(jié)束后(術(shù)后9 d)較治療前(術(shù)后3 d)顯著增加(P<0.01)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較

注：與同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組比較，**P<0.01；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，##P<0.01；與本組術(shù)后3 d比較，△△P<0.01。圖1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較

2.4 各組大鼠腦梗死體積比較

從TTC染色后的大腦切片可見(jiàn)，假手術(shù)組大鼠兩側(cè)大腦半球未受到損傷，模型組和恢刺組大鼠的大腦右半球則均出現(xiàn)了明顯的梗死區(qū)域。與假手術(shù)組比較，模型組的腦梗死體積比明顯增大(P<0.01)。與模型組比較，恢刺組的腦梗死體積比明顯減小(P<0.01)。見(jiàn)表4、圖2。

表4 TTC染色后各組大鼠腦梗死體積比的比較

圖2 TTC染色后各組大鼠腦切片缺血區(qū)比較

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)腦卒中的發(fā)病率和患病率都明顯升高[20]。腦卒中具有高致殘率的特點(diǎn)，痙攣性癱瘓是腦卒中患者突出的后遺癥之一，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[21]。因此，揭示、探討卒中后痙攣的生物學(xué)機(jī)制，摸索、推廣行之有效的治療方法，是卒中后康復(fù)治療研究中的重要環(huán)節(jié)。大量臨床研究證明恢刺法對(duì)卒中后痙攣療效肯定[10-13]，但相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究還有待于完善。

卒中后痙攣是大腦局部血液循環(huán)障礙所致的神經(jīng)功能缺損綜合征在康復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)的后遺癥。因此，本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的線栓法阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈的血流，來(lái)模擬卒中后痙攣的發(fā)生過(guò)程，制備痙攣模型。經(jīng)行為學(xué)和電生理學(xué)評(píng)定，該模型可靠性較高[15]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，該模型大鼠出現(xiàn)肢體痙攣的比例約為50%左右[17,22]。因此，本實(shí)驗(yàn)在45只SD大鼠中隨機(jī)抽取9只作為假手術(shù)組，剩余36只均用于造模，以保證模型組和恢刺組有足夠的樣本量。

毫針刺法和穴位選取是影響針刺療效的重要因素，選擇適合于病癥的刺法和穴位對(duì)于提高臨床療效至關(guān)重要。卒中后痙攣中醫(yī)多以經(jīng)筋病論屬，可以歸于“筋病”“痙證”的范疇，多因“中風(fēng)”后肝腎陰虛、氣血虛衰和脈絡(luò)閉阻不能濡養(yǎng)經(jīng)筋而致，表現(xiàn)為筋肉拘急攣縮、關(guān)節(jié)屈伸不利等。《靈樞·官針》言：“恢刺者，直刺傍之，舉之前后，恢筋急，以治筋痹也?！被执谭ㄊ恰饵S帝內(nèi)經(jīng)》中記載的經(jīng)典刺筋之法，是治療“筋痹”的特色刺法，強(qiáng)調(diào)針刺手法和肢體活動(dòng)的共同作用?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·靈樞集注》言：“恢，大之也。前后恢蕩其筋急”，體現(xiàn)出恢刺法刺激范圍較大的特點(diǎn)，與筋病病灶范圍較大相契合。研究發(fā)現(xiàn)，痙攣狀態(tài)下肌肉的膠原和彈性組織會(huì)發(fā)生纖維化，導(dǎo)致肌肉融合，進(jìn)而加重痙攣[23]。這提示增強(qiáng)對(duì)局部痙攣肌肉的活動(dòng)和松解具有治療意義，為恢刺法從病變肌腱旁進(jìn)針、多向透刺行針和配合活動(dòng)關(guān)節(jié)等刺法特點(diǎn)提供了一定的療效依據(jù)?；执谭ň哂辛夹缘碾p向調(diào)節(jié)作用，一方面能緩解肌肉緊張狀態(tài)，另一方面能激活肌肉功能，可以有效促進(jìn)患病部位主動(dòng)肌和拮抗肌由協(xié)同運(yùn)動(dòng)向分離運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)變，進(jìn)而緩解肌肉痙攣?；执谭▽⑨槾毯瓦\(yùn)動(dòng)有效結(jié)合起來(lái)，與痙攣性疾病的致病特點(diǎn)相適應(yīng)，故抗痙攣效應(yīng)確切[9]。陽(yáng)陵泉為八脈交會(huì)穴之筋會(huì)，能夠通經(jīng)活絡(luò)、舒筋壯骨，是治療筋病的要穴。通過(guò)觀察治療前后中風(fēng)偏癱患者的腦功能磁共振成像(fMRI)，顯示針刺陽(yáng)陵泉可以調(diào)節(jié)特定的腦區(qū)活動(dòng)，對(duì)治療中風(fēng)具有積極有效的作用，能促進(jìn)中風(fēng)偏癱患者腦功能重塑[24-25]。

在缺血性卒中的模型中，TTC染色經(jīng)常被用來(lái)確定腦梗死區(qū)域的大小和快速顯示腦缺氧組織的范圍[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，針刺可以顯著降低MCAO模型大鼠的腦梗死體積比，提高大鼠的運(yùn)動(dòng)功能[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療7 d后，恢刺組大鼠的Zea Longa神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積比都明顯低于模型組，與上述研究結(jié)果相符，提示恢刺法能夠有效改善大鼠的神經(jīng)功能損傷和腦缺血狀態(tài)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用MAS肌張力評(píng)分聯(lián)合網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)來(lái)綜合評(píng)價(jià)大鼠的肌痙攣狀態(tài)及運(yùn)動(dòng)功能的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，隨著針刺治療的推進(jìn)，恢刺組的網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分從術(shù)后5 d開(kāi)始顯著上升，直至治療結(jié)束呈現(xiàn)出穩(wěn)步上升的趨勢(shì)，同時(shí)MAS評(píng)分亦較治療前顯著降低，說(shuō)明恢刺法有效地提高了大鼠的平衡運(yùn)動(dòng)功能，緩解了大鼠的肢體痙攣，其作用穩(wěn)定而持續(xù)。

臨床研究[28]表明，腦血流量的恢復(fù)有利于中風(fēng)患者肢體運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)?；执谭ù碳ち枯^大，并結(jié)合局部肢體運(yùn)動(dòng)，能夠調(diào)暢全身氣血、舒筋活絡(luò)，對(duì)卒中后肌痙攣患者的康復(fù)有著較好的療效[10-13]。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，恢刺法在有效緩解大鼠肌痙攣、協(xié)調(diào)增強(qiáng)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的同時(shí)，明顯改善了大鼠腦缺血的狀態(tài)，提示恢刺法的抗痙攣?zhàn)饔每赡芘c其對(duì)痙攣肌肉局部以及中樞大腦的血流改善均有關(guān)，其機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

綜上，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，恢刺法可緩解卒中后痙攣大鼠的肌痙攣，提高運(yùn)動(dòng)功能，改善腦缺血狀態(tài)，發(fā)揮一定的神經(jīng)功能保護(hù)作用。