Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化陽(yáng)離子交換色譜分離牛初乳中乳鐵蛋白的工藝研究

劉佳欣，賀夢(mèng)瑤 ，湯興楠，欒凱雯

（沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110142）

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為 80 kDa[1]，最早是由Sorensen（1939）在牛乳中一個(gè)未知的“紅色組分”中發(fā)現(xiàn)[2]。乳鐵蛋白在乳中的含量最為豐富，特別是在初乳中含量較高，人初乳中乳鐵蛋白的質(zhì)量濃度可達(dá)到7 mg·mL-1,牛初乳中乳鐵蛋白的質(zhì)量濃度平均為1 mg·mL-1[3]。

乳鐵蛋白作為多功能糖蛋白具有多種生物活性，抗病毒、抗癌[4]、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[5],還具有抑菌功能[6-7]，對(duì)腸道菌群的有一定調(diào)節(jié)作用。目前分離乳鐵蛋白的方法有很多種，如凝膠過(guò)濾層析法、膜分離法，親和色譜法[8-10]等。凝膠過(guò)濾層析操作簡(jiǎn)便所需設(shè)備簡(jiǎn)單，并且層析所用的凝膠屬于惰性載體，不會(huì)影響分離物。但凝膠過(guò)濾層析對(duì)流速要求較高，且對(duì)于分子量相差不多的物質(zhì)難以達(dá)到很好的分離效果[11]。由于LF 的熱穩(wěn)定性差，而膜分離法是一個(gè)不需要加熱，并且不需要化學(xué)試劑的分離方法，因此可以最大限度地保持LF 的生物活性，但膜容易堵塞，不易清洗，分離成本高[12-13]。親和色譜法是一種新興的分離技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)利用固定相的結(jié)合特性實(shí)現(xiàn)對(duì)分子的分離，抗體與抗原作用專一性高、親和力強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)一步分離.但操作費(fèi)用昂貴，不能用于工業(yè)化[14]。本試驗(yàn)試驗(yàn)采用陽(yáng)離子交換色譜CM-Sepharose fast flow 分離牛初乳中的乳鐵蛋白，并對(duì)其分離條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的分離條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

95%乳鐵蛋白，biotopped 公司；牛初乳，木蘭花乳業(yè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)；CM-Sepharose fast flow 5 mL，通用電氣公司；鹽酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，均為分析純，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA purifier，通用電氣公司；高速冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技有限公司；Synergy2 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；HH4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋, 金壇市天瑞儀器有限公司；GB1302 型電子精密天平，梅特勒托利多儀器公司；SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將牛初乳裝入100 mL 離心管中，以10 000 r·min-14 ℃離心30 min，除去上層脂肪；加入1 mol·L-1的稀鹽酸，緩慢添加調(diào)至牛初乳溶液pH 為4.6，水浴加熱40 ℃，保溫30 min，然后放入高速冷凍離心機(jī)中，以10 000 r·min-140 ℃離心30 min，保留上層乳清蛋白，將得到乳清蛋白溶液；

進(jìn)行抽濾，得到的粗樣品，用0.45μm 的微孔濾膜過(guò)濾，得到純凈的樣品。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：CM-sepharose fast flow 預(yù)裝柱5 mL；流動(dòng)相：A 溶液（pH 值為7.0，濃度為0.02 mol·L-1的磷酸緩沖鹽溶液）；B 溶液（pH 值為7.0，濃度為1 mol·L-1NaCl 混合溶液）；洗脫速度1 mL·min-1；進(jìn)樣量: 1 mL，上樣速度1 mL·L-1；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm、475 nm。

1.4 單因素試驗(yàn)

以起始緩沖液pH7、洗脫液濃度1 mol·L-1、洗脫速度1 mL·min-1、上樣速度1 mL·min-1為基本條件，通過(guò)改變單一因素來(lái)探討其對(duì)乳鐵蛋白得率的影響。起始緩沖液分別為6.0、6.5、7、7.5、8.0；洗脫液濃度0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1、洗脫速度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1; 上樣速度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert 軟件，以乳鐵蛋白的得率為影響值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，響應(yīng)面因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素和水平表

1.6 乳鐵蛋白得率的測(cè)定方法

乳鐵蛋白得率（%）=乳鐵蛋白峰面積÷總蛋白峰面積×100%。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)，并通過(guò)SPSS17.0 軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，p＜0.01 差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)結(jié)果用作圖軟件origin9.0 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 穿透曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白的在CM-Sepharose fast flow 離子交換色譜上的穿透曲線如圖 1。試驗(yàn)在流速1 mL·min-1下進(jìn)樣, 由圖1 可見(jiàn)上樣體積達(dá)到1 mL時(shí)達(dá)到穿透點(diǎn), 2 mL 左右CM-Sepharose fast flow 離子交換色譜吸附基本達(dá)到飽和，之后吸附作用開(kāi)始減弱，由此計(jì)算得到, 進(jìn)樣2 mL 左右可以使預(yù)裝柱充分吸附, 因此確定最大上樣量為100 μg·mL-1。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 起始緩沖液pH 對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

圖1 CM-Sepharose fast flow 穿透曲線

圖2 起始緩沖液對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

當(dāng)起始緩沖液pH 在6.0～6.5 時(shí)，乳鐵蛋白得率降低，見(jiàn)圖2，這是因?yàn)楫?dāng)起始緩沖液pH 值為6.5時(shí)，洗脫時(shí)需要高濃度的鹽溶液才可以將乳鐵蛋白洗脫下來(lái)，因此乳鐵蛋白得率降低。當(dāng)起始緩沖液的 pH 為 8.0 時(shí), 乳鐵蛋白基本無(wú)法吸附在CM-Sepharose fast flow 色譜柱上，乳鐵蛋白會(huì)與部分雜蛋白等組分一起率先被洗脫下來(lái)，此時(shí)的乳鐵蛋白得率不高[15-16]。

2.2.2 洗脫液濃度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

洗脫液NaCl 濃度在0.6～1.0 mol·L-1時(shí)，洗脫液濃度越大，乳鐵蛋白得率越高，當(dāng)洗脫液濃度為 0.8 mol·L-1時(shí)乳鐵蛋白得率最高，見(jiàn)圖3。當(dāng)洗脫液濃度繼續(xù)升高，乳鐵蛋白得率下降，這可能是因?yàn)樯俨糠秩檫^(guò)氧化物酶被洗脫下來(lái)。乳過(guò)氧化物酶等電點(diǎn)9.0，高于乳鐵蛋白的等電點(diǎn)，與離子交換介質(zhì)的相互作用力強(qiáng)于乳鐵蛋白。洗脫液濃度過(guò)大，乳過(guò)氧化物酶的相互作用力減弱，也被洗脫下來(lái)，導(dǎo)致乳鐵蛋白得率降低[17-19]。

2.2.3 洗脫速度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

由圖4 可以發(fā)現(xiàn)，洗脫速率為 1.0 mL·min-1的情況下，得到乳鐵蛋白得率最高，而低于或高于此濃度的洗脫流速情況下，CM-Sephadrose fast flow 色譜柱吸附乳鐵蛋白的未能及時(shí)被洗脫下來(lái)，使得乳鐵蛋白得率低。

圖3 洗脫液濃度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

圖4 洗脫速度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

2.2.4 上樣速度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

上樣速率在 0.4～0.8 mL·min-1時(shí)，上樣速率對(duì)乳鐵蛋白得率無(wú)明顯影響，上樣液中的乳鐵蛋白可以充分?jǐn)U散到CM-Sepharose fast flow 色譜柱表面。上樣速率超過(guò)0.8 mL·min-1后，乳鐵蛋白的得率開(kāi)始下降，這是因?yàn)樯蠘铀俾蔬^(guò)快，樣品中的乳鐵蛋白未及時(shí)被離子交換劑表面吸附就從層析柱中沖出，造成乳鐵蛋白流失[20-22]。

圖5 上樣速度對(duì)乳鐵蛋白得率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的構(gòu)建及方差分析

乳鐵蛋白分離試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案以及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸方差分析見(jiàn)表3，擬合所得多元二次回歸方程Y=84.94+0.33A+0.36B+0.23C+0.14D+0.29AB-0.49A C+0.32AD+0.39CD-2.62A2-2.50B2-1.51C2-0.98D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果

由表3 數(shù)據(jù)可知，該回歸模型達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），說(shuō)明該方法是可靠的；失擬項(xiàng)不顯著，R2=0.987 9，表明此模型的擬合程度良好，乳鐵蛋白得率可以用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通過(guò)對(duì)比表3中的F值可以看出，影響乳鐵蛋白得率的主次順序?yàn)椋築＞A＞C＞D，即洗脫速度＞起始緩沖液pH＞洗脫液濃度＞上樣濃度。

表3 回歸模型方差分析表

2.3.2 各因素之間的交互作用

根據(jù)回歸方程做出的各兩因素交互作用的響應(yīng)面分析圖見(jiàn)圖6。起始緩沖液pH（A）和洗脫速度（B）交互作用對(duì)乳鐵蛋白得率的影響顯著。起始緩沖液pH（A）和洗脫液濃度（C）交互作用對(duì)乳鐵蛋白的得率的影響顯著。洗脫液濃度（C）和上樣速度（D）交互作用對(duì)乳鐵蛋白得率的影響顯著。

2.3.3 最優(yōu)條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用Design-Expert8.06 軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到陽(yáng)離子交換色譜法分離乳鐵蛋白的最優(yōu)制備工藝條件為：起始緩沖液pH7.03，洗脫速度1.01 mL·min-1, 洗脫液濃度1.01 mol·mL-1, 上樣速度0.82 mL·min-1, 乳鐵蛋白得率的理論最優(yōu)值為84.98%。參照此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到乳鐵蛋白得率為84.43%，理論值的相對(duì)誤差為0.55%，說(shuō)明該方法具有一定的實(shí)際可操作性。

3 討論

乳鐵蛋白作為一種新興功能性食品配料，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

圖6 各兩因素交互作用的響應(yīng)面

近年來(lái)，乳鐵蛋白的分離純化工藝不斷提高，已成功應(yīng)用于酸奶、嬰幼兒配方奶粉等產(chǎn)品中[23]。楊安樹(shù)[24]等采用 CM-Sepharose fast flow 陽(yáng)離子交換柱對(duì)經(jīng)脫脂、酪蛋白沉淀及超濾后的預(yù)處理樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到純度為95%的乳鐵蛋白。任璐等[25]對(duì)流動(dòng)相不同pH 值對(duì)分離效果的影響作了分析并得出相似結(jié)論，pH 值在7.0～7.3 之間的流動(dòng)相較為適宜，能夠較好地分離LF 與其他雜蛋白?？梢?jiàn)通過(guò)此方法能很好地分離牛初乳中的乳鐵蛋白，為乳鐵蛋白的純化奠定了基礎(chǔ)。