尚依一 劉羅 龐明杰 張艷

(1.昆明理工大學醫(yī)學院 昆明理工大學附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032； 2.云南省第一人民醫(yī)院心內科，云南 昆明 650032； 3.云南省第一人民醫(yī)院磁共振影像科，云南 昆明 650032)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一組以室間隔和/或左心室不對稱性肥厚為主要特點的常見遺傳性心肌病，是青少年心源性猝死的主要原因[1-2]。其發(fā)病機制尚未完全明確，臨床表現(xiàn)及嚴重程度差異較大[3-4]，臨床上多采取對癥治療，但治療效果欠佳[5]，嚴重者會發(fā)生心力衰竭及猝死，危及生命。

近年來，對HCM病理生理學機制研究的不斷深入，其治療已向分子靶向藥物和基因治療方向轉變[6]。HCM的基因研究始于30年前，由于HCM患者的早期臨床癥狀并不顯著[7]，而基因檢測可在臨床疾病發(fā)病早期識別HCM患者，從而達到早期診斷、及時干預和判斷預后的目的，因此，基因檢測已成為歐洲和北美指南中Ⅰ類推薦的檢查[8-9]。

自1990年Geisterfer-Lowrance等[10]發(fā)現(xiàn)β-肌球蛋白重鏈基因(β-myosin heavy chain gene，MYH7)以來，相繼多個基因被標記為HCM致病基因[11]。盡管在隨后的幾年，基因檢測取得了巨大的進展，但檢測體系覆蓋不全，仍有40%的患者存在除已發(fā)現(xiàn)基因外的其他突變，且這些突變數(shù)目較多，提示HCM仍有致病基因有待發(fā)現(xiàn)。此外，遺傳變異的機制通路仍不十分清楚，尤其是一些較罕見的突變。

目前，檢測基因突變的方法較多，例如：經典的限制性片段長度多態(tài)性、單鏈構象多態(tài)性、高分辨率熔解曲線分析、實時熒光PCR檢測、毛細管電泳和高通量測序等，以上技術各有優(yōu)缺點。Sanger測序是目前所有基因檢測的國際金標準，讀取速度快，測序片段長，準確率高，但測序試劑昂貴，對于無明確突變基因的測序篩查難以完成；限制性片段長度多態(tài)性、單鏈構象多態(tài)性和高分辨率熔解曲線分析等方法相對簡單，但靈敏性和準確性差；毛細管電泳技術具備高效、快速等優(yōu)點，但由于進樣量少，因而制備能力差；高通量測序技術主要適用于大規(guī)?；驕y序，但設備要求高，臨床上難以普及；實時熒光PCR具有快速、簡便和準確等特點，但耗材十分昂貴，且不能監(jiān)測擴增產物的大小?，F(xiàn)對HCM的基因突變常見檢測手段作一歸納總結。

1 基因突變對HCM的影響

自HCM的第一個致病基因被發(fā)現(xiàn)以來，在過去的30年已發(fā)現(xiàn)了共23個相關致病基因[11]，其主要的發(fā)病機制包括心肌細胞鈣循環(huán)及鈣敏感性降低，導致心臟收縮及舒張功能障礙，肌原纖維收縮功能受損而導致的代償性心肌肥厚以及心肌舒張功能障礙，心肌細胞纖維化增加和微血管功能障礙等，但這些致病機制的各個環(huán)節(jié)并不十分明確。HCM絕大部分為常染色體顯性遺傳，由編碼心臟肌小節(jié)蛋白基因的突變所致，其中有4個基因變異的頻率較高。

1.1 心肌肌球蛋白結合蛋白C3

1995年，心肌肌球蛋白結合蛋白C3(cardiac myosin binding protein-C3，MYBPC3)突變第一次被Watkins的研究團隊[12]所報道，這也是被報道出的首個與家族遺傳性HCM相關的基因，而經過后期實驗研究證實，20%～25%的HCM是由MYBPC3的突變引起。與HCM相關的MYBPC3突變90%以上含有提前終止密碼子并編碼截斷的蛋白質[13]。MYBPC3突變會使蛋白功能失調，從而引起心臟肌球蛋白C的親和力降低，導致C端和肌球蛋白結合域受影響，無法固定肌小節(jié)結構，致使蛋白質被迅速降解，不能整合到肌絲中。

1.2 MYH7

MYH7是肌球蛋白最重要的亞單位之一，約占肌球蛋白總量的95%，位于染色體14q12，1990年，Geisterfer-Lowranc等[10]發(fā)現(xiàn)該基因中13號外顯子的一個錯義突變會導致HCM。MYH7突變占HCM的35%～50%，在該基因上已發(fā)現(xiàn)的近200個突變點位通過影響MYH7球狀頭端的三磷酸腺苷分解位點和肌動蛋白的結合位點，降低粗肌絲和細肌絲的親和力，進而導致HCM[14-15]。

1.3 心肌肌鈣蛋白T基因

1994年，Akhtar等[16]發(fā)現(xiàn)另一個引起突變的基因：心肌肌鈣蛋白T基因(TNNT2)。該基因占HCM患者的5%～15%，且常顯示出一個特定表型。研究表明，TNNT2的致病突變大部分為錯義突變，這種突變會導致左心室肥大伴隨不同程度的心肌細胞纖維化[14，17]。雖然TNNT2突變所導致的HCM心肌肥厚程度較輕，但發(fā)生心源性猝死的風險卻很高，且預后都較差。

1.4 心肌肌鈣蛋白I基因

心肌肌鈣蛋白I基因(TNNI3)是肌鈣蛋白復合物的抑制亞基，位于19號染色體p1區(qū)域，8個外顯子，可編碼210個氨基酸[17]，其作用是抑制肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性。該基因突變表現(xiàn)為混合型、形態(tài)學特征不明顯的心肌病[14]。5%左右的HCM是由該基因突變所致。國外研究發(fā)現(xiàn)TNNI3的第186位氨基酸由精氨酸變?yōu)楦拾彼幔@種改變表現(xiàn)出HCM和左心室非致密化不全的混合形態(tài)特征[14，18]。

2 基因檢測類型

2.1 ACMG-AMP指南與心肌病遺傳評估

在基因檢測中，由于人類基因組的復雜性及缺乏可靠的研究驗證其功能和確定位點變異所導致的臨床表現(xiàn)的原因，美國醫(yī)學遺傳學及基因組學學會(ACMG)和分子病理學協(xié)會(AMP)提出了解釋遺傳變異的最新指南[19]，其中包括分類的標準化，應納入評估中的數(shù)據(jù)及該數(shù)據(jù)的相對大小，為變異解釋提供了一個框架[20]。

心肌病的基因評估在心肌病確診后進行，這其中就包含了基因檢測，由于心肌病與ACMG列表中27%的基因相關，并且屬于表型，與另一些疾病所表現(xiàn)出的臨床癥狀相似，難以鑒別，所以在一定程度上，基因檢測還為心肌病的鑒別診斷和治療方法提供了重要指導[21]。

如前文所述，HCM被認為是肌節(jié)病，編碼肌節(jié)蛋白的基因變異是引起HCM的常見原因。其檢測的診斷率為30%～60%，在已知HCM家族史的個體檢測發(fā)病率則更高[22]，并且還具有基因型狀態(tài)的預后價值。

Robyns等[23]在評估HCM的基因型和表型之間的關系時發(fā)現(xiàn)，對篩選的3個基因型：WYBPC3、MYH7和TNNT2采用變性高壓液相色譜檢測后，對異常結果進行了Sanger測序，并在這個過程中嚴格采用ACMG-AMP標準，其在37%的患者中檢測出了基因突變，并且發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)患者MYBPC3和MYH7以及肌鈣蛋白復合物TNNT2、TNNI3存在突變；同時據(jù)其他研究表明，MYH7和MYBPC3中的致病性變異約占所有可行性分子診斷病例的80%[24]。除了肌節(jié)基因外，在HCM患者中核心篩選的基因還包括GLA、PRKAG2和LAMP2[21]。

在Robyns等的試驗中，部分患者確診時較年輕，而病情卻更加嚴重，包括心肌明顯肥大和更加頻繁的暈厥，但心源性猝死的發(fā)生率并沒有因為不同的突變而顯示較大差異，而是基本相似的[23]。

在隨后的病例隨訪當中研究者們發(fā)現(xiàn)，與陰性突變患者相比，陽性突變患者處于較高的風險當中，并且還有數(shù)據(jù)顯示MYBPC3突變攜帶者的生存期較差，這與Charron等[25]提出的“與MYBPC3相比，MYH7突變攜帶者的生存期較差”這一理論剛好相反，這或許是由于研究者樣本中MYBPC3突變的攜帶者出現(xiàn)了更加嚴重的表型。但不可否認的是，MYH7仍是HCM、擴張型心肌病和限制型心肌病等幾種心肌病的主要致病基因。因為它們有較高的合并患病率且對于患者健康有嚴重威脅，MYH7依舊是臨床實踐中檢測最常見的基因之一。

2.2 用目標外顯子捕獲技術和二代測序技術對HCM進行基因篩查

目前，二代測序是發(fā)展最快的測序技術，主要特點是通量大，測序速度快，可邊測序邊合成，幾乎滿足當前測序的全部需求，而外顯子捕獲技術是一種選擇基因組編碼序列的高效策略，對研究已知基因的單核苷酸多態(tài)性、插入缺失等基因組變異檢測具有較大的優(yōu)勢，應用于罕見病、遺傳代謝病的病因查找。

張智文等[26]通過對1個HCM家系目標區(qū)域測序發(fā)現(xiàn)，α-輔肌動蛋白是在心肌中唯一表達的肌肉亞型，而ACTN2基因是編碼該亞型的基因之一。該基因的c.1162T>A突變后，會導致第388位由色氨酸轉換成精氨酸，輕度或中度HCM與該種蛋白質的突變存在一定的相關性。該突變在1000 Genomes及dbSNP數(shù)據(jù)庫中報道較少，為罕見變異，而同時為罕見變異的還有MYBPC3基因c.472G>A雜合突變。

MYBPC3的免疫球蛋白樣結構域C2是由其第14號外顯子所編碼的，而外顯子后的一段序列所編碼的纖維連接蛋白Ⅲ型結構域包含了肌球蛋白及肌聯(lián)蛋白的結合位點，若這其中的某段或某個序列發(fā)生了錯義突變，那么該蛋白會被迅速降解，使得心肌肌球蛋白的結構和功能發(fā)生改變，無法像正常蛋白一樣固定粗肌絲，進而影響肌小節(jié)的功能，而這種突變也會導致第158號的纈氨酸轉換成甲硫氨酸，導致HCM的發(fā)生。這種變異所致的HCM一般會于中年后發(fā)病，發(fā)病時間晚，且心肌肥厚程度較輕，病程進展也較為緩慢。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，在TNNI3中，也存在c.235C>T的突變，TNNI是一種抑制亞基，由TNNΙ3基因所編碼，有阻斷肌動蛋白和肌球蛋白間相互作用，介導橫紋肌松弛的作用，在TNNI3發(fā)生突變后蛋白第79號的精氨酸轉換成半胱氨酸，使得橫紋肌松弛，功能受損，介導HCM的發(fā)生。而研究人員在后續(xù)的研究中也發(fā)現(xiàn)，HCM同時存在兩個以上的基因突變是非常罕見的，且臨床癥狀會更加嚴重。

這種檢測方法有助于篩查家系突變基因，對HCM患者的治療方案和其家系成員的早期診斷具有較高實用價值，并且對突變攜帶者的早期干預和遺傳咨詢具有非常重要的臨床意義。

2.3 HCM致病基因熱點突變位點TaqMan-MGB探針檢測法

HCM具有較強的臨床遺傳異質性，導致了攜帶有不同突變位點的HCM患者臨床表型或發(fā)病時間存在差異，因此對HCM的預防尤為重要。隨著遺傳疾病基因突變檢測方法的進步和發(fā)展[27-28]，以及在臨床HCM診斷方面的推廣與應用[29-30]，基因檢測和家族篩查在臨床早期診斷中發(fā)揮著越來越關鍵的指導作用[31-32]。

王玉鑫等[28]經過實驗發(fā)現(xiàn)，TaqMan-MGB探針技術具有淬滅效果好、探針短和結合穩(wěn)固等優(yōu)點，是檢測基因突變的強有力工具。同時，TaqMan-MGB實時熒光PCR方法能在封閉的PCR管內快速、靈敏、準確地檢測到單個堿基的突變，成本較低，且對儀器設備要求不高，對基因檢測具有很好的推廣作用[33-34]。

研究人員通過對TaqMan-MGB實時熒光PCR引物探針擴增條件及引物探針靈敏性、特異性和重復性進行探索和優(yōu)化，以陽性突變的HCM患者基因組為模板進行回復性驗證，建立了5個與HCM發(fā)病相關的突變位點(MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c2155C>T、TNNI3-c.433C>G和PRKAG2-c.298G>A)的實時熒光PCR檢測方法[28]。與傳統(tǒng)的TaqMan不同的是：TaqMan-MGB在其3’端連接了非熒光的猝滅基團MGB，當探針序列與模板結合時，MGB能高度結合于DNA雙鏈的小溝，增加了寡核苷酸探針和單鏈模板結合的穩(wěn)定性。同時，TaqMan-MGB通過縮短探針序列長度，增加其特異性，實現(xiàn)了單堿基的區(qū)分能力[28]。當具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶對堿基進行延伸時，可將發(fā)光基團解離下來，解除了非熒光猝滅基團對發(fā)光基團的抑制，實現(xiàn)熒光信號積累與PCR的同步進行，從而能較好地區(qū)分野生型、純合突變和雜合突變樣本。TaqMan-MGB在單核苷酸多態(tài)性檢測方面有較多的應用[35-37]，如慢性骨髓增殖性疾病、病原微生物的耐藥突變和某些腫瘤細胞基因突變檢測等。

3 總結

基因檢測的結果是概率性的而不是決定性的，所以必須根據(jù)患者的病史和家族史來解釋檢測結果，并且在特殊情況下應考慮遺傳病因。根據(jù)目前所研究的結果及ACMG-AMP指南，筆者認為，在HCM患者的基因檢測工作中：(1)若根據(jù)目前對基因和/或變異組的現(xiàn)有知識已確定了心血管表型，采用常規(guī)方法進行評估；(2)若未在個體中識別出心血管疾病表型，可進行定期篩查；(3)若未在個體中識別出心血管疾病表型，但在親屬中已檢測出該疾病的基因突變體，根據(jù)該病變的發(fā)病特征及該基因或變體組一般年齡和系譜信息，則可考慮對高危親屬進行基因方面的聯(lián)級評估，及時發(fā)現(xiàn)該家族中致病基因的攜帶情況。

隨著基因工程技術的發(fā)展，HCM的治療方向已慢慢向基因與分子靶向技術轉變，從根源上探究這種疾病的發(fā)病機制，對HCM的治療有明確的指導意義。