李尚泉 陳佳 何秀苗

摘要：【目的】明確廣西北部灣海洋細菌胞外多糖（EPS）獨特的抗腫瘤等生物學活性，為北部灣海域細菌EPS活性研究及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。【方法】采集廣西欽州茅尾海紅樹林淺層土壤樣品，使用LB-苯胺藍培養(yǎng)基及苯酚—硫酸法篩選EPS高產海洋細菌，基于16S rRNA序列進行菌株鑒定;通過高效凝膠滲透色譜和紅外光譜測定EPS的分子量及其結構，最后使用噻唑藍（MTT）法測定EPS對Vero細胞的毒性及抑制HeLa細胞增殖的效果?！窘Y果】篩選出1株EPS產量為0.2917 mg/mL的菌株，命名為QLc-04，在LB-苯胺藍固體培養(yǎng)基上生長形成的菌落呈白色，不透明，中央略微隆起，表面粗糙，為革蘭氏陽性桿菌。QLc-04與芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株的16S rRNA序列相似性在99.45%～99.82%，其中與B. thuringiensis BT62（CP044978）的相似度最高（99.82%），與B. cereus ATCC 14579T（AE016877）和B. mycoides DSM 2048T（ACMU01000002）相似性均為99.81%;在基于16S rRNA序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹上，QLc-04與芽孢桿菌屬聚類為同一分支，因此確定QLc-04為芽孢桿菌屬。QLc-04-EPS分子量約179.9 kD，屬于具有吡喃型結構的多糖;QLc-04-EPS對Vero細胞無直接毒性，在10～300 μg/mL濃度范圍內Vero細胞隨QLc-04-EPS濃度的增加其增殖能力不斷升高，但QLc-04-EPS濃度超過50 μg/mL時對HeLa細胞增殖的抑制作用顯著增強（P<0.05）?！窘Y論】海洋芽孢桿菌QLc-04經發(fā)酵培養(yǎng)36 h其EPS產量為0.2917 mg/mL;QLc-04-EPS為典型吡喃型多糖，分子量為179.9 kD，具有顯著抑制HeLa細胞增殖的作用。

關鍵詞： 海洋芽孢桿菌;胞外多糖（EPS）;吡喃型結構;細胞毒性;抗腫瘤

中圖分類號： S917.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-3166-08

Isolation and identification of an extracellular polysaccharide high-producing marine Bacillus and the study

on its anti-tumor activity

LI Shang-quan， CHEN Jia， HE Xiu-miao*

（School of Marine Sciences and Biotechnology， Guangxi University for Nationalities/Guangxi Key Laboratory for Polysaccharide Materials and Modifications，? Nanning? 530006， China）

Abstract：【Objective】The aim of the present study was to determine the biological activities， such as antitumor acti-vity of the extracellular polysaccharide（EPS） from marine bacteria in Beibu Bay， Guangxi，and to provide reference basis for the research，development and application of the biological activity of the EPS secreted by bacteriafrom Beibu Bay. 【Method】The shallow soil samples of Maowei Sea mangrove in Qinzhou， Guangxi were collected. The marine bacteria with high production of EPS were screened by LB-aniline blue culture medium and phenol-sulfuric acid method， and the strains were identified by 16S rRNA sequence. The molecular weight and structure of the EPS were determined by high performance gel permeation chromatography and infrared spectroscopy. Finally， the cytotoxicity of the EPS to Vero cells and the inhibitory effect on the proliferation of HeLa cells were determined by thiazolyl blue（MTT） method. 【Result】The results showed that a strain named QLc-04， with EPS production of 0.2917 mg/mL was screened. The colony of QLc-04 formed on LB-aniline blue solid medium was white， opaque， slightly raised in the center and rough on the surface. QLc-04 was identified to be Gram-positive bacilli. QLc-04 showed 99.45% to 99.82% 16S rRNA sequence similarity to Bacillus，with the highest similarity to B. thuringiensis BT62（CP044978）（99.82%），then 99.81% to B. cereus ATCC 14579T（AE016877） and B. mycoides DSM 2048T（ACMU01000002）. In the phylogenetic tree based on 16S rRNA? sequence si-milarity， QLc-04 and Bacillus were clustered into the same branch， so that QLc-04 was identified to be Bacillus. The mole-cular weight of QLc-04-EPS was about 179.9 kD and the EPS belonged to a polysaccharide with pyranoid structure. The QLc-04-EPS had no significant cytotoxicity to Vero cells. In the concentration between 10-300 μg/mL， the more QLc-04-EPS was used， the stronger proliferation ability of Vero cell was. However，when the concentration of QLc-04-EPS was more than 50 μg/mL， the inhibitory effect on HeLa cell proliferation was significantly enhanced（P<0.05）. 【Conclusion】The production of EPS secreted by marine Bacillus QLc-04 is 0.2917 mg/mL after 36 h fermentation. QLc-04-EPSis a typical pyran polysaccharide with a molecular weight of 179.9 kD， and shows a significantly inhibitory effect on the proliferation of HeLa cells.

Key words： marine Bacillus; extracellular polysaccharides（EPS）; pyranoid structure; cytotoxicity; anti-tumor

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（32160824）;Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFAA198033）; Innovation Project of Guangxi Graduate Education（YCSW2020134）

0 引言

【研究意義】近年來，越來越多研究表明各類多糖具有獨特的生物活性，包括抗腫瘤、增強免疫力、抗凝及抗病毒等（Yu et al.，2018;趙爽等，2019;石子林等，2020），其中黃芪多糖和細菌莢膜多糖等已廣泛應用于臨床治療血栓、調理免疫力及作為疫苗佐劑等（Yu et al.，2018;陳燦輝等，2019）。微生物種類繁多、數(shù)量龐大，相對于植物多糖和動物多糖而言，微生物多糖更易控制、提取及大規(guī)模生產。廣西北部灣海域獨特的氣候環(huán)境使其極有可能蘊含產生新型生物活性多糖的細菌，因此，分析廣西北部灣海洋細菌胞外多糖（Extracellular polysaccharides，EPS）抗腫瘤活性有利于提高對廣西北部灣海洋細菌潛在生物活性的認知，對廣西北部灣海洋微生物資源的開發(fā)與利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】至今，國內外學者已針對不同海域的微生物EPS活性進行了大量研究。Wu等（2016）從我國東海海底沉積物中分離出1株斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri 273），其EPS能有效抑制銅綠假單胞菌（P. aeruginosa PAO1）的細胞膜形成;Abdelnasser等（2017）從地中海中分離出2株EPS對HepG2肝癌細胞具有抑制作用的芽孢桿菌（Bacillus）;Casillo等（2017）研究表明，海洋嗜冷菌Colwellia psychrerythraea 34H的EPS可作為防凍劑;Zhang等（2017）從我國南海海水中分離獲得類單胞菌屬細菌（Alteromonas sp. JL2810），并證實該菌株所產EPS對重金屬具有良好的吸附作用;王菊（2019）從海洋中分離出1株芽孢桿菌，能通過下調細胞粘附分子CD99致使人肝癌細胞Huh7.5粘附能力下降，破壞偽足結構機制而達到抗癌癥效果;Sahana和Rekha（2020）研究證實泛生菌屬（Pantoea sp.）海洋細菌YU16-S3的EPS能通過Wnt/β-catenin途徑促進創(chuàng)傷愈合?？梢?，海洋細菌EPS具有巨大應用前景。針對廣西北部灣海域，王松柏（2005）從北部灣紅樹林泥樣中篩選出270株海洋細菌，發(fā)現(xiàn)海洋短小芽孢桿菌（B. pumilus）PLM4株的EPS在125 μg/mL濃度下對Hep-2癌細胞系抑制率高達96.58%;付婷婷（2015）從廣西北海海水樣品中分離得到18株產EPS微藻，其中1株小球藻（Chlorella）BH95所產EPS初步純化后（500 μg/mL）對DPPH·清除率為47.40%，1000 μg/mL時對羥基自由基（·OH）清除率為56.09%;郭甜甜（2015）從廣西潿洲島紅樹林根泥中分離出1株真菌Aspergillus versicolor PJX-9，其EPS清除DPPH·、超氧陰離子自由基（O2-·）和·OH的半有效濃度（EC50）分別為3.39、1.50和1.72 mg/mL;陳博文等（2019）從北部灣篩選出28株EPS具有抗氧化能力的細菌，對DPPH·的清除率為9.43%～71.10%?！颈狙芯壳腥朦c】已有研究表明，從廣西北部灣海域能分離出各類生產EPS的微生物（王松柏，2005;付婷婷，2015;郭甜甜，2015;陳博文等，2019），但關于該海域細菌EPS抗腫瘤活性的研究鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】從廣西北部灣近岸海域相關樣品中分離鑒定出EPS高產菌株，并進一步通過噻唑藍（MTT）法鑒定EPS的抗腫瘤活性，明確廣西北部灣海洋細菌EPS獨特的抗腫瘤等生物學活性，為北部灣海域細菌EPS活性研究及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

細菌分離所用泥樣取自廣西欽州茅尾海紅樹林（東經108°60′～108°76′，北緯21°61′～21°83′），去除表層泥土后采用無菌打孔器獲取50 cm深的泥樣，將泥樣裝入滅菌玻璃瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆?。LB海水培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水500.0 mL，人工海水500.0 mL，pH 7.4～7.6。LB-苯胺藍培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，水溶苯胺藍5.0 g，蒸餾水500.0 mL，人工海水500.0 mL，pH 7.4～7.6。產糖液體培養(yǎng)基：蔗糖4.0 g，酵母粉3.0 g，CaCO3 0.1 g，蒸餾水500.0 mL，人工海水500.0 mL，pH 7.4～7.6（馬晶璟，2010）。Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR購自TaKaRa公司，2×Taq Plus Master Mix購自康為世紀生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，改良型RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Thermo公司，胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司，噻唑藍（MTT）購自美國Amresco公司，二甲基亞砜（DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司，HeLa細胞和Vero細胞購自中國科學院上海細胞庫，葡萄糖、無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚及濃硫酸均為國產分析純。

1. 2 EPS高產菌株篩選

泥樣用無菌人工海水混勻，取部分液體進行十倍梯度稀釋（10-1～10-6）。各濃度梯度取50.0 μL涂布于LB-苯胺藍固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑選黏稠、體積大、藍色較深的菌落在LB固體培養(yǎng)基上繼續(xù)劃線純化，再挑選單菌落轉接種至25.0 mL的LB液體培養(yǎng)液中，30 ℃搖床（180 r/min）培養(yǎng)9 h獲取種子液。取1.5 mL種子液加入48.5 mL LB液體培養(yǎng)基，27 ℃搖床（180 r/min）振蕩培養(yǎng)36 h，然后取10.0 mL發(fā)酵液，加入等體積的 2.0 mol/L NaOH，顛倒混勻10次，室溫放置20 min后12000 r/min離心30 min，取上清液，以3 mol/L HCl調整pH至6.0，3000 r/min離心30 min，肉眼觀察EPS沉淀量，選擇沉淀量多的菌株測定EPS含量。以葡萄糖為標準曲線，通過苯酚—硫酸法（楊勤等，2020）測定EPS含量，篩選出EPS產量較高的菌株。

1. 3 細菌種屬鑒定

參照Clarke等（2007）的方法設計測序鑒定引物GM5F（5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3'），委托北京六合華大基因科技有限公司合成。取適量菌體加入含50.0 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR的1.5 mL EP管中，移液器混勻，80 ℃孵育15 min后8000 r/min離心1 min，取4.0 μL上清液為PCR模板。PCR反應體系25.0 μL：2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，DNA模板4.0 μL，GM5F和907R引物各1.0 μL，滅菌ddH2O 6.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸1 min。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR擴增產物在590 bp附近出現(xiàn)明顯的目的條帶，送至深圳華大基因股份有限公司測序。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，使用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap設為500次檢驗其可靠性。

1. 4 EPS提取及純化

將種子液8000 r/min離心30 min，取上清液，加入4倍體積的95%乙醇，上下顛倒混勻10次，再用搖床振蕩2 min，充分混勻，放入4 ℃冰箱過夜，8000 r/min離心15 min，棄上清液，剩余沉淀即為粗多糖。向粗多糖中加入雙蒸水，邊加入邊混勻，直至完全溶解，粗多糖溶液和Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）按4∶1進行配比，搖床振蕩30 min，雜蛋白為凝膠狀沉淀，4000 r/min離心20 min后小心吸取上層多糖溶液，重復操作，直至兩相之間無乳白色沉淀且分層明顯。采用紫外分光光度計對200～400 nm波段進行掃描，觀察260和280 nm處的吸收峰以檢測EPS純度，若仍有蛋白繼續(xù)純化。純化的EPS以95%乙醇沉淀，再-20 ℃真空冷凍干燥過夜。

1. 5 EPS分子量及紅外光譜分析

選用分子量為4400、9900、21400、43500、124000、196000和277000 Da的標準葡聚糖為標準品，使用色譜柱為Waters Ultrahydrogel Linear 7.8×300的高效凝膠色譜儀進行檢測，進樣量為30.0 μL，流速為1 mL/min，樣品濃度為1%，流動相為三蒸水，繪制標準曲線。將純化EPS用三蒸水溶解，相同條件下檢測其分子量及純度。稱取2.0 mg純化EPS和200.0 mg溴化鉀，分別研磨并混勻壓片進行紅外掃描檢測。

1. 6 EPS細胞毒性檢驗

純化EPS配制成高濃度溶液，經0.22 μm過濾器過濾，涂布于LB固體培養(yǎng)基確定無菌后備用。以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將無菌EPS配制成10、30、50、100、300和500 μg/mL的溶液，使用MTT法檢驗EPS對Vero細胞是否具有毒性。Vero細胞在96孔細胞培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，每組5個重復孔，確保每孔50.0 μL培養(yǎng)基中含Vero細胞數(shù)為5×104個。各試驗組每孔加入50.0 μL不同濃度的EPS溶液，空白組則加入50.0 μL培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，于每孔中加入20.0 μL MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h后每孔加入150.0 μL DMSO，低速振蕩10 min，使用酶標儀檢測490 nm處的吸光值。

1. 7 EPS對腫瘤細胞增殖的抑制作用

在96 孔細胞培養(yǎng)板中運用MTT法檢驗EPS對HeLa細胞增殖的抑制作用，每組5個重復孔。用改良RPMI-1640完全培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HeLa細胞，待細胞鋪滿后進行細胞消化并稀釋，確保每孔50.0 μL培養(yǎng)基中含HeLa細胞數(shù)為5×104個。各試驗組加入配制好的不同濃度EPS溶液（50.0 μL/孔），空白組則加入50.0 μL培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，顯微鏡觀察各濃度的細胞狀態(tài)。參照戴碧濤等（2005）的方法，計算EPS對HeLa細胞的抑制率（%）=[1-（試驗組吸光值/空白組吸光值）]×100。

2 結果與分析

2. 1 EPS高產菌株篩選結果

采集的泥樣經稀釋涂布于LB-苯胺藍固體培養(yǎng)基上，篩選得到167株產EPS的海洋細菌，將培養(yǎng)基背面觀察呈藍色的菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，采用苯酚—硫酸法測定EPS產量，結果得到1株EPS產量較高的菌株，其EPS產量為0.2917 mg/mL，命名為QLc-04。QLc-04在LB-苯胺藍固體培養(yǎng)基上生長形成的菌落呈白色，不透明，中央略微隆起，表面粗糙（圖1-A）;從LB-苯胺藍固體培養(yǎng)基背面觀察，其菌落中央呈藍色或藍紫色（圖1-B）;革蘭氏染色鏡檢顯示QLc-04為革蘭氏陽性桿菌（圖1-C）。

2. 2 種屬鑒定結果

以QLc-04裂解液為模板，擴增其16S rRNA序列，測序后使用NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，結果顯示QLc-04與芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株的相似性在99.45%～99.82%，其中與B. thuringiensis BT62 （CP044978）的相似度最高（99.82%），與B.cereus ATCC 14579T（AE016877）和B. mycoides DSM2048T（ACMU 01000002）相似性均為99.81%?；?6S rRNA序列相似性構建QLc-04與部分芽孢桿菌屬模式菌株及其他屬菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果發(fā)現(xiàn)QLc-04與芽孢桿菌屬聚類為同一分支（圖2），因此可確定QLc-04為芽孢桿菌屬。

2. 3 QLc-04-EPS的分子量及紅外光譜分析結果

將QLc-04發(fā)酵液離心去除菌體后，經95%乙醇沉淀及多次Sevage法除蛋白純化，紫外分光光度計檢測結果顯示QLc-04-EPS中的雜蛋白已除去，EPS純度較高（圖3）。獲得的純化QLc-04-EPS通過高效凝膠滲透色譜測定分子量，結果證實QLc-04-EPS的分子量約179.9 kD（圖4）。

紅外光譜分析結果（圖5）顯示，3405 cm-1處為糖類多羥基中O-H伸縮振動峰;2942 cm-1處出現(xiàn)弱吸收峰，為C-H伸縮振動峰;1623 cm-1為結晶水中O-H彎曲振動吸收峰或C=O伸縮振動峰;1419 cm-1是C-H變角振動吸收峰;1126 cm-1為吡喃型糖環(huán)C-O變角特征振動峰;但未見S=O及C-O-S的吸收峰，表明QLc-04-EPS結構內無硫酸根基團，即QLc-04-EPS為吡喃型典型多糖結構。

2. 4 QLc-04-EPS的細胞毒性檢測結果

通過MTT法檢測QLc-04-EPS對細胞的毒性作用，結果（表1）表明，在10～500 μg/mL濃度范圍內QLc-04-EPS對Vero細胞無直接毒性;在10～300 μg/mL濃度范圍內，Vero細胞隨QLc-04 EPS濃度的增加其增殖能力不斷升高。使用SPSS 22.0進行LSD檢驗，結果顯示各濃度處理間無顯著差異（P>0.05）。

2. 5 QLc-04-EPS對腫瘤細胞增殖的抑制作用

不同濃度的QLc-04-EPS作用于HeLa細胞，通過MTT法檢測HeLa細胞增殖情況，如表2所示。當QLc-04-EPS濃度為10～30 μg/mL時，HeLa細胞的增殖情況與空白對照組相似，但QLc-04-EPS濃度超過50 μg/mL時對HeLa細胞增殖的抑制作用顯著增強（P<0.05，下同），當QLc-04-EPS濃度達500 μg/mL時，QLc-04-EPS對HeLa細胞增殖的抑制率達62.25%。同時通過細胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，QLc-04-EPS濃度在10～100 μg/mL時HeLa細胞增殖變化不明顯;但QLc-04-EPS濃度達300 μg/mL時，可觀察到HeLa細胞密度降低、收縮成團，且細胞變得扁長;當QLc-04-EPS濃度達500 μg/mL時，大部分HeLa細胞開始收縮、細胞形態(tài)變得不完整并出現(xiàn)死亡現(xiàn)象（圖6），與MTT法檢測結果基本一致。

3 討論

EPS對細菌抵抗外源環(huán)境壓力具有非常重要的生理意義（Limoli et al.，2015）。海洋環(huán)境具有高壓、低氧、高鹽及重金屬含量高等特點，細菌為應對這些外部生存壓力會通過分泌EPS或形成特殊細胞壁多糖，以保護海洋細菌免受環(huán)境傷害，同時賦予海洋細菌產生各類具有特殊生物活性EPS的潛力。本研究從廣西欽州茅尾海紅樹林淺層土壤中篩選出1株高產EPS的芽孢桿菌，命名為QLc-04;該菌株經發(fā)酵培養(yǎng)36 h后其EPS產量為0.2917 mg/mL，較房耀維等（2012）篩選獲得的海洋細菌B. subtilis OST23a誘變育種后的EPS產量高;QLc-04-EPS的分子量為179.9 kD，紅外光譜分析證實其具有典型的吡喃型多糖官能團，對Vero細胞無毒副作用，但具有抑制HeLa細胞增殖的作用。該結論為海洋菌株EPS抗腫瘤活性的進一步研究和利用打下了基礎。

有關芽孢桿菌產多糖及其活性分析，Diao等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬LBP32的EPS通過抑制IκB激酶（IKK）磷酸化，而消除核因子κB（NF-κB）的激活，同時阻礙絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）的激活，進而達到抑制LPS誘導促炎性介質的細胞效果;Mahdhi等（2018）在高鹽環(huán)境分離獲得1株芽孢桿菌（Bacillus spp.），并證實其EPS可抑制生物被膜形成，以及減少與細菌黏附和抗菌素耐藥性有關的外排泵外排;蔡淼等（2020）從酒曲中分離到的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌GSBm-1，優(yōu)化后的EPS產量達522.8 mg/L，其EPS不僅具有清除DPPH·和ABTS+自由基的作用，還能通過抑制α-葡萄糖苷酶而發(fā)揮降血糖作用。本課題組前期也從廣西北部灣海域分離出多株具有抗氧化功能的不同種屬海洋細菌EPS（陳博文等，2019），由此說明芽孢桿菌EPS具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤及調節(jié)免疫等多種活性功能，且不同菌株的EPS生物學活性存在明顯差異。

EPS的抗腫瘤活性與其結構密切相關。多糖分子量越大越易溶于水，其抗腫瘤能力越強。Ren等（2012）研究表明具有高活性抗腫瘤的松茸多糖分子量約10.0 kD，但也有研究表明相對分子質量小于 400.0 kD的香菇多糖具有較高的抗腫瘤活性（Zhang et al.，2011）。本研究中，QLc-04-EPS的分子量為179.9 kD，表現(xiàn)出對HeLa細胞增殖有較強的抑制能力。此外，分子量高于90.0 kD的多糖具有較強的免疫學調節(jié)活性（Ohno et al.，2001），因此QLc-04-EPS的免疫調節(jié)活性有待進一步探究?？鼓[瘤多糖大多以葡聚糖為基礎結構，但也有研究表明以甘露糖、葡萄糖和半乳糖等吡喃糖為單糖構型的多糖具有明顯抗腫瘤活性（Ren et al.，2012;聶少平等，2018;商婷婷等，2019）。海洋短小芽孢桿菌（B. pumilus PLM4）EPS的分子量為116.0 kD，EPS的糖基為D-甘露吡喃糖和D-葡萄吡喃糖構型，同時含有較多己糖醛酸與少量丙酮酸，純化EPS在125 μg/mL濃度下對Hep-2癌細胞系的抑制率高達96.58%（王松柏，2005）。香菇多糖LNT2的結構僅由D-吡喃葡萄糖組成，在800 μg/mL時對肝癌實體瘤細胞H22的最大抑制率為52.62%（李石軍等，2014）。曹若冰（2018）從海洋中篩選出1株芽孢桿菌，EPS分子量為22.3 kD，其構型為雜多糖，含有甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和木糖吡喃型多糖，對A549、H1299、H460細胞的抑制率分別為80%、67%和47%。本研究中，QLc-04-EPS的結構為典型吡喃型多糖結構，也表現(xiàn)出抗腫瘤活性的潛力，當其濃度達500 mg/mL時對HeLa細胞增殖的抑制率達62.25%，但抑制癌細胞增殖的機制有待進一步探究。

4 結論

海洋芽孢桿菌QLc-04經發(fā)酵培養(yǎng)36 h其EPS產量為0.2917 mg/mL;QLc-04-EPS為典型吡喃型多糖，分子量為179.9 kD，具有顯著抑制HeLa細胞增殖的作用。

參考文獻：

蔡淼，陳超，曹永強，楊貞耐. 2020. 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌產胞外多糖發(fā)酵條件及生物活性研究[J]. 食品科學技術學報，38（2）：48-58. [Cai M，Chen C，Cao Y Q，Yang Z N. 2020. Research on fermentation conditions and bioactivity of exopolysaccharide produced by Bacillus methylotrophicus[J]. Journal of Food Science and Technology，38（2）：48-58.] doi：10.3969/j.issn.2095-6002.2020.02.007.

曹若冰. 2018. 一種海洋芽孢桿菌胞外多糖的純化鑒定及抗腫瘤機制研究[D]. 青島：中國科學院大學. [Cao R B. 2018. Purification，identification and antitumor mechanism studies of a marine polysaccharide isolated from a marine bacillus[D]. Qingdao：University of Chinese Academy of Sciences.]

陳博文，成鑫花，廖秋妮，陳艷艷，李尚泉，吳家法，龍寒，禤金彩，劉紅全，何秀苗. 2019. 廣西北部灣近海產胞外多糖細菌多樣性及其抗氧化活性分析[J]. 南方農業(yè)學報，50（10）：2335-2342. [Chen B W，Cheng X H，Liao Q N，Chen Y Y，Li S Q，Wu J F，Long H，Xuan J C，Liu H Q，He X M. 2019. Diversities and antioxidant activities of exopolysaccharide-producing marine bacteria isolated from Beibu Gulf Coast in Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture，50（10）：2335-2342.] doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.10.26.

陳燦輝，江文韜，林彤，莊瑋婧，鄭寶東，李舒婷，鄭亞鳳. 2019. 竹筍多糖的提取、結構鑒定與生理功效研究進展[J]. 江蘇農業(yè)學報，35（6）：1513-1520. [Chen C H，Jiang W T，Lin T，Zhuang W J，Zheng B D，Li S T，Zheng Y F. 2019. Progress in extraction，structural characterization and biological activities of bamboo shoot polysaccharide[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，35（6）：1513-1520.] doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2019.06.034.

戴碧濤，蔣紀愷，王付麗，張彥，張莉萍. 2005. 苦參堿聯(lián)合抗腫瘤藥抑制K562細胞增殖的研究[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，27（5）：392-394. [Dai B T，Jiang J K，Wang F L，Zhang Y，Zhang L P. 2005. Inhibitory effect of matrine combined with antineoplastic on proliferation of K562 cells[J]. Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae，27（5）：392-394.] doi：10.3321/j.issn：1000-5404.2005.05.006.

房耀維，劉姝，呂明生，焦豫良，陳麗，王淑軍. 2012. 產抗氧化胞外多糖海洋細菌Bacillus subtilis OST23a的誘變育種[J]. 食品科學，33（13）：187-190. [Fang Y W，Liu S，Lü M S，Jiao Y L，Chen L，Wang S J. 2012. Mutation of marine strain Bacillus subtilis OST23a to obtain a high-yield antioxidant exopolysaccharides-producing strain[J]. Food Science，33（13）：187-190.]

付婷婷. 2015. 產多糖海洋微藻篩選、培養(yǎng)及其多糖提取與抗氧化性研究[D]. 南寧：廣西大學. [Fu T T. 2015. Screening，cultivation a marine microal and extracting polysaccharide with antioxidant activity[D]. Nanning：Guangxi University.] doi：10.7666/d.Y3087378.

郭甜甜. 2015. 四株海洋來源微生物胞外多糖的結構和抗氧化活性研究[D]. 青島：中國海洋大學. [Guo T T. 2015. Structural characterizations and antioxidant activities of the extracellular polysaccharides produced by four marine microorganisms[D]. Qingdao：Ocean University of China.]

李石軍，王凱平，汪柳，辜明，曾芳，張玉. 2014. 香菇多糖LNT2的提取分離純化、結構及體外抗腫瘤活性研究[J]. 中草藥，45（9）：1232-1237. [Li S J，Wang K P，Wang L，Gu M，Zeng F，Zhang Y. 2014. Isolation，purification，structural elucidation，and antitumor activity in vitro of lentinan LNT2[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，45（9）：1232-1237.] doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2014. 09.007.

馬晶璟. 2010. 產胞外多糖細菌的分離和鑒定[D]. 合肥：安徽大學. [Ma J J. 2010. Isolation and identification of extracellular polysaccharides producing bacteria[D]. Hefei：Anhui University.] doi：10.7666/d.Y2261190.

聶少平，唐煒，殷軍藝，謝明勇. 2018. 食源性多糖結構和生理功能研究概述[J]. 中國食品學報，18（12）：1-12. [Nie S P，Tang W，Yin J Y，Xie M Y. 2018. Research progress on structure and functional activities of food-derived polysaccharides[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，18（12）：1-12.] doi：10.16429/j. 1009-7848.2018.12.001.

商婷婷，李天鳳，周靖，黃雪峰. 2019. 植物多糖的構效關系的研究進展[J]. 廣東化工，46（8）：99-100. [Shang T T，Li T F，Zhou J，Huang X F. 2019. Advances in research on structure-activity relationship of plant polysaccharides[J]. Guangdong Chemical Industry，46（8）：99-100.] doi：10.3969/j.issn.1007-1865.2019.08.039.

石子林，李軍喬，王雅瓊，董浩，牛永昆，李晨芹. 2020. 蕨麻地上部分多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性[J]. 江蘇農業(yè)學報，36（3）：720-726. [Shi Z L，Li J Q，Wang Y Q，Dong H，Niu Y K，Li C Q. 2020. Optimization on the extraction process of polysaccharide from the aerial part of Potentilla anserina L. and its antioxidant activity[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，36（3）：720-726.] doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2020.03.026.

王菊. 2019. 海洋細菌胞外多糖EPS11抗腫瘤轉移機制研究[D]. 青島：中國科學院大學. [Wang J. 2019. Anti-metastasis mechanism study of exopolysaccharides EPS11 from marine bacterium[D]. Qingdao：University of Chinese Aca-demy of Sciences.]

王松柏. 2005. 海洋細菌Bacillus pumilus PLM4抗腫瘤胞外多糖的研究[D]. 南寧：廣西大學. [Wang S B. 2005. The primary research of antitumor exopolysaccharide of marine Bacillus pumilus PLM4[D]. Nanning：Guangxi University.] doi：10.7666/d.Y728202.

楊勤，谷文超，周濃，張?zhí)m勝，楊德全. 2020. 苯酚—硫酸法與蒽酮—硫酸法測定地參多糖的比較研究[J]. 食品科技，45（1）：343-350. [Yang Q，Gu W C，Zhou N，Zhang L S，Yang D Q. 2020. Comparison of phenol-sulfuric acid and anthrone-sulfuric methods for determination of polysaccharide in Lycopus lucidus Tilrcz. var. Hirtus Regel[J]. Food Science and Technology，45（1）：343-350.] doi：10.13684/j.cnki.spkj.2020.01.056.

趙爽，高宜，榮成博，蘇哲，劉宇，馬傳貴，袁超，趙仲麟. 2019. 不同蜜環(huán)菌屬真菌胞外多糖生物功能的研究[J]. 河南農業(yè)大學學報，53（2）：213-217. [Zhao S，Gao Y，Rong C B，Su Z，Liu Y，Ma C G，Yuan C，Zhao Z L. 2019.Study on bioactivities of extracellular polysaccharides of different genus of Armillaria[J]. Journal of Henan Agricultural University，53（2）：213-217.] doi：10.16445/j.cnki. 1000-2340.2019.02.009.

Abdelnasser S M，Yahya S M M，Mohamed W F，Asker M M，Abu Shady H M，Mahmoud M G，Gadallah M A. 2017. Antitumor exopolysaccharides derived from novel marine Bacillus：Isolation，characterization aspect and biological activity[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，18（7）：1847-1854. doi：10.22034/APJCP.2017. 18.7.1847.

Casillo A，Parrilli E，Sannino F，Mitchell D E，Gibson M I，Marino G，Lanzetta R，Parrilli M，Cosconati S，Novellino E，Randazzo A，Tutino M L，Corsaro M M. 2017. Structure-activity relationship of the exopolysaccharide from a psychrophilic bacterium：A strategy for cryoprotection[J]. Carbohydrate Polymers，156：364-371. doi：10.1016/j.carbpol.2016.09.037.

Clarke A M，Kirby R，Rose P D. 2007. Molecular microbial ecology of lignocellulose mobilisation as a carbon source in mine drainage wastewater treatment[J]. Water SA，30（5）：658-661. doi：10.4314/wsa.v30i5.5179.

Diao Y，Xin Y Q，Zhou Y，Li N，Pan X L，Qi S M，Qi Z L，Xu Y M，Luo L，Wan H G，Lan L，Yin Z M. 2014. Extracellular polysaccharide from Bacillus sp. strain LBP32 prevents LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages by inhibiting NF-κB and MAPKs activation and ROS production[J]. International Immunopharmacology，18（1）：12-19. doi：10.1016/j.intimp.2013.10.021.

Limoli D H，Jones C J，Wozniak D J. 2015. Bacterial extracellular polysaccharides in biofilm formation and function[J]. Microbiology Spectrum，3（3）：10. doi：10.1128/microbiolspec.MB-0011-2014.

Mahdhi A，Leban N，Chakroun I，Bayar S，Mahdouani K，Majdoub H，Kouidhi B. 2018. Use of extracellular polysaccharides， secreted by Lactobacillus plantarum and Bacillus spp.， as reducing indole production agents to control biofilm formation and efflux pumps inhibitor in Escherichia coli[J]. Microbial Pathogenesis，125：448-453. doi：10.1016/ j.micpath.2018.10.010.

Ohno N，Miura T，Miura N N，Adachi Y，Yadomae T. 2001. Structure and biological activities of hypochlorite oxidized zymosan[J]. Carbohydrate Polymers，44（4）：339-349. doi：10.1016/S0144-8617（00）00250-2.

Ren L，Perera C，Hemar Y. 2012. Antitumor activity of mushroom polysaccharides：A review[J]. Food & Function，3（11）：1118-1130. doi：10.1039/c2fo10279j.

Sahana T G，Rekha P D. 2020. A novel exopolysaccharide from marine bacterium Pantoea sp. YU16-S3 accelerates cutaneous wound healing through Wnt/β-catenin pathway[J]. Carbohydrate Polymers，238：116191. doi：10.1016/j.carbpol.2020.116191.

Wu S M，Liu G，Jin W H，Xiu P Y，Sun C M. 2016. Antibiofilm and anti-infection of a marine bacterial exopolysaccharide against Pseudomonas aeruginosa[J]. Frontiers in Microbiology，7：102. doi：10.3389/fmicb.2016.00102.

Yu Y，Shen M Y，Song Q Q，Xie J H. 2018. Biological activities and pharmaceutical applications of polysaccharide from natural resources：A review[J]. Carbohydrate Polymers，183：91-101. doi：10.1016/j.carbpol.2017.12.009.

Zhang Y Y，Li S，Wang X H，Zhang L N，Cheung P C K. 2011. Advances in lentinan：Isolation，structure，chain conformation and bioactivities[J]. Food Hydrocolloids，25（2）：196-206. doi：10.1016/j.foodhyd.2010.02.001.

Zhang Z L，Cai R H，Zhang W H，F(xiàn)u Y N，Jiao N Z. 2017. A novel exopolysaccharide with metal adsorption capacity produced by a marine bacterium Alteromonas sp. JL2810[J]. Marine Drugs，15（6）：175. doi：10.3390/md15060175.

收稿日期：2020-08-29

基金項目：國家自然科學基金項目（32160824）;廣西自然科學基金項目（2017GXNSFAA198033）;廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目（YCSW2020134）

通訊作者：何秀苗（1975-），https：//orcid.org/0000-0002-8622-9177，博士，教授，主要從事分子病毒學與免疫學研究工作，E-mail：xiumiaohe0839@sina.com

第一作者：李尚泉（1994-），https：//orcid.org/0000-0002-7763-4277，研究方向為分子病毒學，E-mail：1024269140@qq.com

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