母波，趙春艷，胡先華，張人丹

(川北醫(yī)學(xué)院，1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.四川省醫(yī)學(xué)影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝細(xì)胞癌的90%[1]，是世界上第四大癌癥死亡原因[2-3]。雖然肝細(xì)胞癌的預(yù)防、早期診斷和綜合治療已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，預(yù)后不良仍然是肝細(xì)胞癌臨床面臨的重大難題[4]。因此，急需進(jìn)一步探討肝細(xì)胞癌分子生物學(xué)特征和發(fā)病機(jī)制。L-精氨酸是一種半必需氨基酸，是蛋白質(zhì)生物合成的底物以及一氧化氮和多胺的前體，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化中起著至關(guān)重要的作用[5-6]。有研究[7-8]表明，L-精氨酸與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。溶質(zhì)載體家族7成員2(SLC7A2，也稱為CAT2)是半必需氨基酸L-精氨酸(L-Arg)的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[9]。Coburn等[10]研究表明，SLC7A2在調(diào)節(jié)結(jié)腸炎相關(guān)癌變(CAC)的乙氧基甲烷(AOM)-DSS模型中結(jié)腸腫瘤發(fā)生中起作用。SLC7A2在慢性結(jié)腸炎的發(fā)生中對(duì)CAC的保護(hù)具有重要作用，并表明炎癥性腸病(IBD)中SLC7A2的減少可能會(huì)導(dǎo)致CAC風(fēng)險(xiǎn)[11]。Kesavardhana等[12]通過分析預(yù)后良好與不良的患者的基因表達(dá)譜，確定了SLC7A2基因的表達(dá)與乳腺癌患者具有較為明顯的生存優(yōu)勢相關(guān)；并基于回歸分析進(jìn)一步建立了SLC7A2作為一種新型的乳腺癌獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。這些發(fā)現(xiàn)提示SLC7A2可能在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。然而，SLC7A2的表達(dá)水平及其在HCC中的作用尚不清楚。本研究通過綜合生物信息學(xué)分析確定SLC7A2在HCC和正常人群表達(dá)差異，并探討其在HCC中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中的生物信息學(xué)分析

從TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集檢索377個(gè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織和50個(gè)正常對(duì)照的3級(jí)數(shù)據(jù)，如mRNA-seq數(shù)據(jù)、甲基化數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。篩選掉無完整的特異性TNM分期和生存數(shù)據(jù)，369例接受肝切除術(shù)的患者被納入本研究，其中364例HCC患者具有完整的mRNA、CNA和甲基化數(shù)據(jù)，SLC7A2表達(dá)與臨床相關(guān)性分析根據(jù)OS的最佳閾值入組患者為339例。原始計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的歸一化和正常對(duì)照與HCC組織之間差異表達(dá)基因的鑒定采用R(R3.6.3)語言進(jìn)行分析，設(shè)定P<0.05和|log2|>1定義為閾值。TCGA數(shù)據(jù)集中33種腫瘤組織的SLC7A2 mRNA表達(dá)水平采用GEPIA[13]進(jìn)行綜合分析。SLC7A2 DNA甲基化、拷貝數(shù)改變(copy number alterations，CNA)則利用cBioPortal[14]進(jìn)行研究。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0和R版3.6.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用t檢驗(yàn)評(píng)估不同臨床病理組SLC7A2的表達(dá)。SLC7A2在HCC中的診斷價(jià)值采用ROC曲線判斷，并計(jì)算曲線下面積(AUC)。生存數(shù)據(jù)(死亡或復(fù)發(fā))利用R版本3.6.3計(jì)算最優(yōu)閾值，將基因表達(dá)水平分為低表達(dá)和高表達(dá)組。SLC7A2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性用χ2評(píng)估。低表達(dá)組和高表達(dá)組之間的總生存率(overall survival，OS)和無病期間(disease free interval，DFI)通過Kaplan-Meier(K-M)分析和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)比較。HCC的OS或DFI相關(guān)的獨(dú)立指標(biāo)利用Cox模型確定和列線圖進(jìn)行評(píng)價(jià)，并計(jì)算95%置信區(qū)間(CI)和危險(xiǎn)比(HR)。通過線性回歸分析評(píng)價(jià)SLC7A2 mRNA表達(dá)與SLC7A2 DNA甲基化水平的相關(guān)性。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLC7A2在HCC組織中表達(dá)下調(diào)

SLC7A2在正常人體組織和腫瘤組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，包括肝細(xì)胞癌組織在內(nèi)，多數(shù)腫瘤中SLC7A2表達(dá)下調(diào)(圖1 A-B)。ROC曲線顯示SLC7A2下調(diào)對(duì)HCC具有顯著的診斷價(jià)值(圖1C)。

2.2 SLC7A2低表達(dá)與肝細(xì)胞癌腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)

根據(jù)OS的最佳閾值將入組的患者(n=339)分割成低或高SLC7A2表達(dá)組，以研究SLC7A2表達(dá)的臨床意義。 兩組患者在年齡、性別、癌癥家族史、腫瘤TNM分期、低分化腫瘤、Ishak評(píng)分和Child-Pugh分級(jí)等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 然而，SLC7A2低表達(dá)與血清甲胎蛋白(AFP)陽性、血管侵犯、殘余腫瘤、復(fù)發(fā)和死亡顯著相關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.3 Cox模型證明HCC中SLC7A2表達(dá)的預(yù)后價(jià)值

為評(píng)估SLC7A2低表達(dá)對(duì)于肝細(xì)胞癌患者是否具有預(yù)后判斷價(jià)值，首先根據(jù)最優(yōu)閾值生成KM曲線，評(píng)估SLC7A2表達(dá)在HCC中與OS和DFI之間的關(guān)系。 結(jié)果顯示SLC7A2低表達(dá)與HCC患者OS具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.006)，而與DFI沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.09)(圖1D-E)。Cox回歸分析顯示在單因素模型中，HCC中血管侵犯、TNM分期中，SLC7A2低表達(dá)與OS顯著相關(guān)(P<0.05)；多因素分析顯示，SLC7A2低表達(dá)也僅與HCC的OS具有相關(guān)性(HR=0.89，95%CI=0.8～0.99，P=0.032)，而與DFI無相關(guān)(HR=0.95，95%CI=0.86～1.06，P=0.348)(表2、表3)。 SLC7A2的低表達(dá)在HCC不同TNM分期，仍然僅與HCC 的OS相關(guān)性顯著(P<0.05)，而與DFI不相關(guān)(P>0.05)。見圖2。

表1 肝細(xì)胞癌患者SLC7A2基因表達(dá)的臨床相關(guān)性[n(%)]

表2 Cox危險(xiǎn)回歸模型預(yù)測SLC7A2表達(dá)與HCC DFI臨床相關(guān)性

表3 Cox比例回歸模型預(yù)測SLC7A2表達(dá)與HCC OS臨床相關(guān)性

2.4 列線圖模型證明HCC中SLC7A2表達(dá)的預(yù)后價(jià)值

用于OS預(yù)測的基因組-臨床病理模型的CI指數(shù)為0.638(95% CI=0.609～0.667)，用于DFI預(yù)測的基因組-臨床列線圖的CI指數(shù)為0.641(95% CI=0.616～0.666)。見圖3。

2.5 HCC中SLC7A2的表達(dá)下調(diào)基于DNA拷貝缺失和SLC7A2甲基化減少

在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中具有完整的mRNA、CNA和甲基化數(shù)據(jù)(n=364)的HCC患者中，26例(7.14%)有SLC7A2拷貝數(shù)深度缺失，224例(61.53%)有SLC7A2拷貝數(shù)低水平缺失，SLC7A2拷貝缺失與SLC7A2m RNA低表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.05)(圖4A)。線性回歸分析表明，SLC7A2m RNA表達(dá)與其總DNA甲基化水平(Pearson’s R=-0.27，P<0.001)具有明顯的相關(guān)性(圖4B)。

3 討論

近年來，隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，HCC的早期發(fā)現(xiàn)和更個(gè)性化的腫瘤治療得到了發(fā)展，其中關(guān)鍵生物標(biāo)志物的識(shí)別是至關(guān)重要的一步[15]。 SLC7A2已被證實(shí)在多種腫瘤中下調(diào)，可作為結(jié)腸癌和乳腺癌的生物標(biāo)志[11-12，16]。 然而，SLC7A2的表達(dá)水平及其在HCC中的作用和臨床意義尚未被研究。本研究發(fā)現(xiàn)與正常肝組織中相比，肝細(xì)胞癌組織中SLC7A2 mRNA水平上明顯下調(diào)，且通過ROC曲線評(píng)估，其對(duì)HCC具有良好的診斷價(jià)值，提示SLC7A2可能是一種有益于HCC分子和病理診斷的有前途的生物標(biāo)志物。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SLC7A2的低表達(dá)與血清AFP陰性、血管浸潤、復(fù)發(fā)和死亡有關(guān)，表明SLC7A2可能與HCC的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)(P<0.05)。KM分析表明，SLC7A2低表達(dá)的HCC患者OS相對(duì)更差(P<0.05)，而DFI差異不具有顯著性(P>0.05)。多指標(biāo)COX分析也證實(shí)SLC7A2低表達(dá)是HCC 的OS不利獨(dú)立指標(biāo)。

目前，考慮到個(gè)別HCC患者預(yù)后的顯著異質(zhì)性，TNM分期系統(tǒng)的預(yù)后作用不夠精確，建立基因組-臨床-病理列線圖來預(yù)測術(shù)后患者的長期預(yù)后是非常必要的[4]。與TNM分期系統(tǒng)相比，基因組-臨床病理列線圖代表了更精確的預(yù)后模型。本研究中基于SLC7A2mRNA表達(dá)和TNM分期構(gòu)建的列線圖模型預(yù)測結(jié)果表明，SLC7A2有望作為一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后因素，以改善肝細(xì)胞癌患者臨床決策的術(shù)后監(jiān)測(生存和復(fù)發(fā))，并可成為一種額外的治療手段。血清生物標(biāo)志物具有相對(duì)缺乏的敏感性和特異性[17]。本研究HCC組織中SLC7A2的下調(diào)與血清AFP表達(dá)水平顯著相關(guān)。因此，確定HCC患者血清SLC7A2的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)血清SLC7A2在HCC中的獨(dú)立或聯(lián)合(如AFP和GP73)診斷和評(píng)估預(yù)后價(jià)值，用于早期無創(chuàng)篩查和早期發(fā)現(xiàn)HCC術(shù)后復(fù)發(fā)，可能具有較為重要意義。

為研究HCC中SLC7A2低表達(dá)的原因，本研究從DNA缺失和表觀遺傳改變的角度探討了HCC中SLC7A2下調(diào)的潛在機(jī)制。觀察到在具有完整的mRNA、CNA和甲基化數(shù)據(jù)HCC患者中(n=364)，有250例(68.67%)HCC患者 SLC7A2具有低水平(n=224，61.53%)或高水平(n=26，7.14%)的DNA缺失，這與SLC7A2表達(dá)降低顯著相關(guān)。大量研究[18-20]顯示DNA甲基化異常與各種惡性腫瘤的染色體不穩(wěn)定和基因下調(diào)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)SLC7A2mRNA表達(dá)與其在HCC中的DNA甲基化水平之間存在顯著的相關(guān)性(P<0.001)。提示遺傳(DNA拷貝缺失)和表觀遺傳(DNA甲基化減少)的改變都有助于肝細(xì)胞癌SLC7A2的表達(dá)降低。

綜上所述，與正常肝組織相比，SLC7A2在HCC組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，可能是由于SLC7A2 DNA拷貝缺失和低甲基化所致。此外，SLC7A2的低表達(dá)與HCC的進(jìn)展關(guān)系密切，并可獨(dú)立預(yù)測肝細(xì)胞癌患者的不良OS。然而，SLC7A2表達(dá)所涉及到的信號(hào)通路以及在HCC中的確切作用機(jī)制，需要更深入研究來進(jìn)一步闡明。