添加沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干中亞硝胺的抑制作用

劉建林，趙麗華，孫學穎，王 丹，張曉蓉，楊 帆

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 呼和浩特010020 2 鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學院 內(nèi)蒙古鄂爾多斯017000）

發(fā)酵肉制品是目前廣大消費者喜愛的肉制品之一。由于亞硝酸鹽具有護色、防腐、抗氧化以及形成特有風味等作用，已成為發(fā)酵肉制品生產(chǎn)過程中必不可少的添加劑。然而，在生產(chǎn)流通過程中，亞硝酸鹽可與胺類物質(zhì)形成強致癌物N-亞硝胺[1]。過量N-亞硝胺的存在不僅影響食品的風味，而且具有致癌性、致畸性以及致突變性，會對人體造成極大的危害[2]。發(fā)酵肉制品中亞硝胺控制的研究主要集中在前體物質(zhì)控制（亞硝酸鹽和生物按）、香辛料阻斷以及輻照、生物降解等方面。添加香辛料以及發(fā)酵劑是目前控制發(fā)酵肉制品中亞硝胺含量最安全、最有效并值得研究的2 種方法[2-3]。

向發(fā)酵肉制品中接種具有降解亞硝胺能力的微生物，不僅可以抑制亞硝胺的形成，縮短發(fā)酵肉制品的成熟期，延長貨架保質(zhì)期，還能促進發(fā)酵肉制品中蛋白質(zhì)和脂肪的分解，生成氨基酸、肽和揮發(fā)性脂肪酸等，促進風味的形成。添加天然香辛料不僅對發(fā)酵肉制品中亞硝酸鹽和亞硝胺的形成有一定清除和阻斷能力，而且可以促進發(fā)酵肉制品中風味的形成[4-5]。Liao 等[6]將植物乳桿菌120、釀酒酵母2018 和木糖葡萄球菌135 接種于中國傳統(tǒng)發(fā)酵魚類產(chǎn)品上，發(fā)現(xiàn)3 株菌株均能直接降解N-亞硝基二甲胺（NDMA），使其含量顯著低于未經(jīng)處理的傳統(tǒng)發(fā)酵樣品，其中植物乳桿菌120 的降解率最高。Mah 等[7]將大蒜等香辛料加入韓國腌鳳尾魚和發(fā)酵鳳尾魚中，結(jié)果表明大蒜提取物可通過抑制生物按的形成，進而控制亞硝胺的生成。

本研究將實驗室篩選出的植物乳桿菌X3-2B和天然香辛料沙蔥添加到發(fā)酵羊肉干中，研究其對羊肉干發(fā)酵過程中亞硝胺含量、理化指標（pH值、水分活度、色差）以及亞硝酸鹽殘留量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

背最長脊羊肉，巴盟察右中旗放牧羊；食鹽，中國鹽業(yè)集團有限公司；白砂糖，太古糖業(yè)（中國）有限公司；葡萄糖、亞硝酸鈉、硝酸鈉和氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；亞硝胺混標，美國Sigma 公司；甲醇，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；植物乳桿菌X3-2B，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室提供；沙蔥，購于鄂爾多斯市；亞鐵氰化鉀、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、鹽酸，國藥集團化學試劑有限公司；乙酸鋅、硼砂鈉，天津市風船化學試劑科技有限公司。以上試劑中所用水為超純水，甲醇為色譜純級，其余為分析純級試劑。

電子天平（BS210S），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；水分活度儀（Lab Master-a），瑞士NOVASINA 公司；全自動測色色差計（TCP 2），北京奧依克儀器有限公司；UV-1800 型紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；高效液相色譜儀（Agilent 1260vwd），美國Agilent Technologies 公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9802），上海一恒科學儀器有限公司；數(shù)顯式恒溫水浴鍋（HH-6），國華電器有限公司；恒溫恒濕箱（ZXMP-A 1430），上海智城分析儀器制造有限公司；多頭磁力加熱攪拌器（HJ-6），江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；pH 計（pH 400），安萊立思儀器科技（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵羊肉干的制作 將原料肉去除筋腱、筋腱膜和脂肪后，順著肌纖維將羊肉切成長為2～3 cm 的條。加入輔料后將處理好的發(fā)酵劑菌液加入到羊肉條中，使其終含量在羊肉條中達到107CFU/g。將羊肉條與輔料、菌液等混合均勻后進行腌制，腌制12 h 后發(fā)酵。具體試驗分組及輔料添加量見表1。

表1 發(fā)酵羊肉干配方及分組情況Table 1 Recipe and grouping of fermented dried mutton

1.2.2 試驗設(shè)計共制作4 組發(fā)酵羊肉干（對照組、發(fā)酵劑組、沙蔥組、沙蔥+發(fā)酵劑組），在4 個階段（0 d 腌制、2 d 發(fā)酵、5 d 干燥、6 d 成熟）取樣，檢測各項指標。

1.2.3 pH 值的測定 將樣品切碎并準確稱取2.50 g 于50 mL 錐形瓶中，加入22.5 mL 蒸餾水，加入磁性轉(zhuǎn)子，于多頭磁力加熱攪拌器攪拌振蕩10 min 后用pH 計測定pH 值。

1.2.4 水分活度（aw）的測定 將取得的樣品切成細小而均勻的碎塊，鋪滿整個水分活度儀樣品盒后測定。

1.2.5 色差的測定將樣品切成細小而均勻的顆粒狀，肥肉和瘦肉均勻平鋪于色差測定專用器皿中，使用TCP 全自動色差計測定色差。

1.2.6 亞硝酸鹽、亞硝胺含量的測定 亞硝酸鹽含量測定參照GB 5009.33-2016[8]進行。亞硝胺含量測定參照溫演慶等[9]的方法進行。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 8.0 軟件分析，平均值采用Duncan 法進行多重比較，結(jié)果表示為平均值±平均標準差（SD），每個試驗重復3 次。統(tǒng)計學顯著分析P＜0.05 表示差異性顯著，P＜0.01 表示差異性極顯著[10]。采用Excel 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中pH值的影響

如圖1所示，腌制結(jié)束到發(fā)酵結(jié)束（0～2 d），各組羊肉干的pH 值迅速下降（P＜0.05），此階段為產(chǎn)酸主要階段。發(fā)酵結(jié)束后進入干燥期（2～5 d），各組pH 值開始回升（P＜0.05），可能是因為代謝物有機酸的積累抑制了產(chǎn)酸的進行。同時，微生物代謝產(chǎn)生的一些堿性物質(zhì)，如氨和三甲胺也會阻礙pH 值的降低[11]。進入成熟階段后，各組pH 值有緩慢下降的趨勢（P＜0.05），而發(fā)酵劑組的pH 值仍呈上升趨勢。

對比試驗組，對照組的pH 值下降較緩慢，這可能是由于發(fā)酵過程中，對照組的乳酸菌數(shù)量較少且生長緩慢，此時蛋白酶降解肉中的非蛋白氮[12]，從而使pH 值下降較緩慢。添加沙蔥和發(fā)酵劑組的pH 值在發(fā)酵過程中迅速下降（P＜0.05），且都降到5.3 以下，這是因為試驗組在發(fā)酵過程中添加的純菌為優(yōu)勢菌并大量繁殖，添加的天然香辛料能促進乳酸菌的生長，而乳酸菌代謝產(chǎn)生的碳水化合物，尤其是乳酸可使pH 值降低[4]。較低的pH 值環(huán)境有助于抑制致病菌和腐敗菌的生長[13-14]，從而增加制品的食用安全性。發(fā)酵羊肉干成熟后才可正常食用，后期pH 值的回升為發(fā)酵羊肉干增添適合食用的口感，而無酸澀的口感[15]。

2.2 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中aw的影響

低水分活度是柵欄技術(shù)中的關(guān)鍵因子，是發(fā)酵產(chǎn)品貨架期和食用安全的一個重要因素，低水分活度可有效抑制發(fā)酵香腸中的腐敗菌和致病菌的生長，還可以抑制氨基酸脫羧酶的活性，從而控制生物胺的形成[16]。在發(fā)酵過程中，各組aw值在0.94～0.95 之間（圖2），無顯著性差異（P＞0.05）。進入干燥階段，由于工藝條件的變化，aw降至0.77～0.84 之間。當水分活度達到0.88 以下時，發(fā)酵肉干符合規(guī)定標準，事實上低水分活度可以使得許多酶的活性受到抑制[17]。

2.3 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中色差值的影響

肉色是肉及其產(chǎn)品外觀評定的重要指標。通過測定樣品的亮度L*、紅度a*、黃度b*得出e 值，從而反映發(fā)酵羊肉干在制作過程中色差的變化情況。在發(fā)酵肉制品中影響反應色澤最關(guān)鍵的因素是紅度a*，而黃度b*、亮度L*對色澤也有一定的影響。參照方夢琳[18]的方法，引用e 值對發(fā)酵羊肉干的色澤進行評價，計算公式：e=a*/L*+a*/b*。4 組樣品各階段的e 值變化趨勢如圖3d所示。與對照組相比，試驗組e 值在發(fā)酵開始時呈上升趨勢（P＜0.05），說明腌制后亞硝酸鹽開始發(fā)揮作用，在發(fā)酵劑和沙蔥的作用下逐漸將NaNO2轉(zhuǎn)變?yōu)镹O，與瘦肉中的肌紅蛋白結(jié)合形成鮮紅色的一氧化氮肌紅蛋白，使得紅值較高[19]。成熟過程中，各組e值顯著下降（P＜0.05），只有沙蔥+發(fā)酵劑組e 值開始上升，說明發(fā)酵劑和沙蔥開始共同作用，猜測是沙蔥中的某種活性物質(zhì)促進了乳酸菌的生長，使得產(chǎn)品色澤達到最好[20]。

圖1 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中pH 值的影響Fig.1 Effect of scallion and starter on pH value of fermented lamb jerky during production

圖2 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中aw 的影響Fig.2 Effects of scallion and starter on the aw of fermented lamb jerky during production

圖3 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中L*（a）、a*（b）、b*（c）和e（d）值的影響Fig.3 Effects of scallion and starter on the L*（a），a*（b），b*（c）and e（d）value of fermented lamb jerky during production

2.4 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中亞硝酸鹽含量的影響

亞硝酸鹽可與脂肪、蛋白質(zhì)等反應，不僅具有呈色、發(fā)色，增強肉制品風味的作用，還可抑制肉制品脂肪氧化，提高肉制品穩(wěn)定性。在腌制過程中，亞硝酸鹽可在很大程度上抑制肉毒桿菌的生長[21]。如圖4所示，腌制過程中各組亞硝酸鹽含量達到最高（P＜0.05），進入發(fā)酵、干燥階段后，各組亞硝酸鹽含量明顯下降（P＜0.05），說明是具有亞硝酸鹽還原酶菌株的活躍時期[22]。亞硝酸鹽在此階段逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镹O 發(fā)揮呈色等作用。成熟結(jié)束后，沙蔥+發(fā)酵劑組的亞硝酸鹽殘留量明顯高于其它組（P＜0.05），其色澤也優(yōu)于其它組。亞硝酸鹽是強致癌物N-亞硝胺的前體物質(zhì)，亞硝酸鹽的殘留使其與胺類物質(zhì)反應形成強致癌性的亞硝基化合物。

2.5 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中亞硝胺含量的影響

N-亞硝基二甲胺（NDMA）和N-亞硝基嗎啉（NMOR）的含量整體呈下降趨勢（圖5a 和5b）。在腌制結(jié)束后（0 d）2 種亞硝胺的含量較高，可能是由于初始加入的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量較高，其與胺相互作用所致[23]。發(fā)酵結(jié)束后（0～2 d），各組發(fā)酵羊肉干中N-亞硝基二甲胺的含量逐漸下降，含有植物乳桿菌的2 組樣品中NDMA 和NMOR 的含量明顯低于對照組和沙蔥組（P＜0.05），說明添加植物乳桿菌可以降低NDMA 和NMOR 的含量，可能是因為發(fā)酵階段優(yōu)勢菌群迅速生長，使得pH值最低。成熟結(jié)束后（5～6 d），沙蔥+發(fā)酵劑組NDMA 和NMOR 的含量明顯低于其它3 組（P＜0.05），說明共同添加沙蔥和發(fā)酵劑時對發(fā)酵羊肉干中NDMA 和NMOR 2 種亞硝胺的降解效果最好，與本研究結(jié)果類似。Liao 等[6]研究發(fā)現(xiàn)將植物乳桿菌120 接種于中國傳統(tǒng)發(fā)酵魚類產(chǎn)品上，可顯著降低樣品中NDMA 的含量。

圖4 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中亞硝酸鹽含量的影響Fig.4 Effects of scallion and starter on the nitrite content of fermented lamb jerky during production

亞硝基二乙胺（NDEA）是發(fā)酵肉制品中較常見的一種胺類物質(zhì)。由圖5c 可知，整個制作過程中，各組NDEA 的含量整體呈上升趨勢，變化不顯著（P＞0.05），說明添加植物乳桿菌和沙蔥對NDEA 的積累影響較小。成熟結(jié)束后（5～6 d），試驗組NDEA 的含量顯著低于對照組（P＜0.05），而且沙蔥+發(fā)酵劑組的含量最低。

N-亞硝基吡咯（NPYR）和N-亞硝基二正丙胺（NDPA）的含量整體呈先上升后下降的趨勢（圖5d 和5e），且在干燥結(jié)束后（2～5 d）各組NPYR 和NDPA 的含量達到最高值，說明此階段為NPYR和NDPA 的形成提供了適宜的條件（如合適的pH值和aw等）。然而，在成熟結(jié)束后（5～6 d），各組NPYR 和NDPA 的含量顯著降低（P＜0.05），說明此階段環(huán)境的改變抑制了2 種亞硝胺的積累。

圖5 沙蔥與發(fā)酵劑對發(fā)酵羊肉干制作過程中亞硝胺含量的影響Fig.5 Effects of scallion and starter on the nitrosamines of fermented lamb jerky during production

N-亞硝基哌啶（NPIP）和N-亞硝基二正丁胺（NDBA）含量整體呈上升趨勢（圖5f 和5g）。在腌制結(jié)束后（0 d）對照組和試驗組NPIP 和NDBA 的含量都很低，隨著發(fā)酵羊肉干制作過程的進行，2種亞硝胺的含量逐漸上升，說明NPIP 和NDBA 2種亞硝胺是在肉干制作過程中逐漸形成的，添加發(fā)酵劑對NPIP 和NDBA 的積累沒有抑制作用。在成熟結(jié)束后（5～6 d），沙蔥+發(fā)酵劑組NPIP 和NDBA 2 種亞硝胺含量明顯低于其它3 組（P＜0.05），說明同時添加沙蔥和發(fā)酵劑的效果優(yōu)于單獨添加發(fā)酵劑和沙蔥。與本研究類似，Sun 等[24]研究發(fā)現(xiàn)在哈爾濱風干腸中接種戊糖乳桿菌和米酒乳桿菌，對NPIP 的生成沒有顯著的抑制作用。

綜上所述，在發(fā)酵羊肉干中同時加入沙蔥和發(fā)酵劑，可顯著抑制7 種亞硝胺的積累，確保發(fā)酵羊肉干的質(zhì)量安全。

3 結(jié)論

同時添加沙蔥和植物乳桿菌 X3-2B 可顯著降低發(fā)酵羊肉干中亞硝胺（N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基嗎啉、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基吡咯、N-亞硝基二正丙胺、N-亞硝基哌啶和N-亞硝基二正丁胺）的積累，促進發(fā)酵羊肉干pH 值和水分活度的降低，抑制致病菌和腐敗菌的生長，縮短發(fā)酵周期，延長產(chǎn)品的貨架保質(zhì)期，進而提高發(fā)酵羊肉干的產(chǎn)品穩(wěn)定性。沙蔥和植物乳桿菌X3-2B 還在減少亞硝酸鹽殘留量的同時，改善發(fā)酵羊肉干的色澤。將沙蔥與發(fā)酵劑共同應用到發(fā)酵羊肉干的生產(chǎn)中，既可抑制發(fā)酵羊肉干中亞硝胺的積累，又可改善發(fā)酵羊肉干的色澤，增加消費者的購買欲。