李金吉，張銀霞,2，趙 娜，田 蕾,2，楊淑琴,2，李培富,2

(1寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

水稻(OryzasativaL.)是世界上三大糧食作物之一，超過50%的消費者以稻米為主食，因此培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻至關(guān)重要[1]。影響水稻產(chǎn)量的三大要素是有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量，其中千粒質(zhì)量與粒形密切相關(guān)[2]。粒形不僅會影響水稻產(chǎn)量，而且也影響稻米外觀品質(zhì)[3-4]。其主要通過調(diào)控籽粒的粒長、粒寬、粒厚和千粒質(zhì)量等性狀影響水稻產(chǎn)量，而這些性狀均是由多基因控制的數(shù)量性狀(quantitative trait)[5]。所以在研究中需構(gòu)建水稻遺傳分離群體，通過遺傳分析檢測控制粒形性狀的相關(guān)位點并構(gòu)建遺傳群體，將檢測到的位點縮小到一定范圍進(jìn)行克隆。研究表明，采用的遺傳群體和選擇性狀不同，會導(dǎo)致檢測到的位點也不同[5-8]，但其目的均在于研究發(fā)現(xiàn)控制粒形性狀的基因。近20多年來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多控制水稻粒形性狀的QTL位點，并且部分基因已被克隆。Fan等[9]利用大粒親本明恢63和小粒親本Chuan7構(gòu)建近等基因系，定位并克隆基因GS3，該基因與水稻粒長和千粒質(zhì)量有關(guān)；Si等[10]檢測并克隆控制水稻粒長和千粒質(zhì)量的基因GLW7。Li等[11]用寬粒品種珍汕97和細(xì)長粒品種H94檢測到與粒寬有關(guān)基因的GS5；Wang等[12]通過窄粒品種Basmati385和寬粒品種HJX74定位并克隆了控制水稻粒寬的基因GW8；Song等[13]通過構(gòu)建群體進(jìn)行遺傳分析，最終克隆出影響粒寬的基因GW2；Shomura等[14]和Weng等[15]通過遺傳群體Asominori/Nipponbare和IR24/Kasalath檢測發(fā)現(xiàn)基因GW5/qSW5，其主要調(diào)控粒寬；Ishimaru等[16]用寬粒品種Nipponbare和細(xì)長粒品種Kasalath群體，檢測到調(diào)控千粒質(zhì)量的基因TGW6，其主要調(diào)控籽粒的灌漿機(jī)制。另外，林鴻宣等[17]檢測到5個影響籽粒長度的QTL，4個控制籽粒寬度的QTL(其中主效基因和微效基因均為2個)，5個控制粒厚的QTL；趙芳明等[18]鑒定到3個影響千粒質(zhì)量的QTL，2個影響粒長的QTL，2個影響長寬比的QTL；曹立勇等[19]鑒定到9個影響千粒質(zhì)量的QTL。上述研究結(jié)果說明，采用不同的材料和群體所定位到的QTL位點不同。水稻育種中通過利用已克隆的與粒形相關(guān)的基因進(jìn)行一些優(yōu)良品種改良，提高了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此繼續(xù)挖掘新的控制水稻粒形性狀的基因，對于提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。

本研究以大粒稻和東北小粒種(籽粒類似高粱粒，極小)為試驗材料，分析籽粒的粒長、粒寬、千粒質(zhì)量等性狀的遺傳規(guī)律，同時構(gòu)建連鎖遺傳圖譜并檢測其QTL位點，旨在為水稻粒形基因及其調(diào)控提供資源，對提高水稻產(chǎn)量和改良稻米品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料 水稻大粒品種大粒稻、小粒品種東北小粒種及其雜交F1，F(xiàn)1自交獲得的F2群體材料，均由寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室提供。

1.1.2 儀器及試劑 主要儀器：PCR儀(生產(chǎn)于艾本德公司)，凝膠成像儀(生產(chǎn)于耶拿公司)，水平板電泳槽，電泳儀。

主要試劑：DNA提取液(50 mmol/L EDTA-Na2，pH 8.0；100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；500 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)1.25% SDS)、TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0；1 mmol/L EDTA-Na2，pH=8.0)、Tris Base、硼酸、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、瓊脂糖、液體石蠟、 Gelview熒光染料、V氯仿∶V異戊醇=24∶1，均購自寧夏銀川昕泰昌盛生物有限公司；6×loading buffer指示劑、Mixed SSR primer(4 pmol/L)、10×DNA Taq buffer、dNTP(2.5 mmol/L)、Taqenzyme(5 U/μL)， 均購自寧夏銀川潤研生物技術(shù)有限公司。

1.2 表型性狀的遺傳分析

試驗材料于2018年4-5月種植在寧夏大學(xué)水稻育種基地，株距0.1 m，行距0.2 m，常規(guī)水肥管理。水稻植株成熟后，親本、F1各隨機(jī)取3株，F(xiàn)2群體隨機(jī)取256個單株作為遺傳群體。單株收獲后自然晾干，用于表型測定。用游標(biāo)卡尺測量粒長和粒寬，精確到0.01 mm，計算長寬比，每次測定的粒數(shù)均為10粒，重復(fù)3次，取平均值作為各性狀表型值；每份材料取100粒，利用萬分之一電子天平稱量，重復(fù)3次，計算平均值，并折算成千粒質(zhì)量。采用SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.3 水稻粒形性狀遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL定位

1.3.1 DNA提取 在水稻分蘗盛期，采集親本和F2群體的葉片，利用SDS法[20]提取葉片DNA。

1.3.2 遺傳群體SSR分子標(biāo)記檢測 以總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：DNA模板(10 ng/μL)2 μL，Mixed SSR primer(4 pmol/μL)1.5 μL，10×DNA Taq buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.4 μL，Taqenzyme(5 U/μL)0.4 μL，加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s(退火溫度視引物而定)，72 ℃延伸1 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR特異性引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司北京分公司合成。

分子標(biāo)記檢測：采用3.6%瓊脂糖凝膠或8%聚丙烯酰胺凝膠(19∶1)電泳檢測SSR擴(kuò)增產(chǎn)物。采用改進(jìn)的銀染法[21]檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。

1.3.3 連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL定位 利用寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室保存的1 558對SSR標(biāo)記，篩選親本間多態(tài)性標(biāo)記，然后用篩選出的多態(tài)性標(biāo)記對F2群體進(jìn)行分子檢測。電泳檢測結(jié)果與大粒稻帶型相同的記為B，與東北小粒種帶型相同的記為A，雜合帶型記為H，缺失或不清的帶型記為“-”，獲得基因型數(shù)據(jù)。利用MapManagerQTXb20分析數(shù)據(jù)，劃分可能的連鎖群，檢測粒形的QTL位點，計算各個位點的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)，以P<0.01作為判斷QTL存在的閾值。利用Mapchart 2.2軟件繪制遺傳連鎖圖譜。QTL命名原則遵循McCouch[22]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻親本、F1及F2群體粒形性狀的遺傳分析

水稻親本、F1、F2群體籽粒粒形性狀平均值見表1。

表1 水稻親本、F1、F2群體籽粒粒形性狀平均值Table 1 Rice grain traits in F2,F1 and their parents

由表1可以看出，親本大粒稻的粒長、粒寬、長寬比和千粒質(zhì)量分別為8.74 mm、4.24 mm、2.06、38.98 g；雙親大粒稻與東北小粒種的粒長、粒寬、長寬比和千粒質(zhì)量的差值分別為4.05 mm、1.04 mm、0.59、26.94 g。F1的粒長、粒寬、長寬比及千粒質(zhì)量分別為7.66 mm、3.62 mm、2.12、30.03 g。F2群體各性狀表型均值介于雙親之間，且均偏向親本大粒稻。

從F2群體粒形性狀頻次分布圖(圖1)可知，F(xiàn)2群體中4個粒形性狀均呈現(xiàn)連續(xù)變異的雙峰分布，且粒長、長寬比和千粒質(zhì)量均偏向于親本大粒稻。這表明粒長、粒寬、長寬比及千粒質(zhì)量均是由多個基因控制的數(shù)量性狀，能夠進(jìn)行QTL定位分析。

圖1 水稻F2群體粒形性狀頻次分布圖Fig.1 Frequency distribution of grain shape traits for rice F2 population

2.2 水稻F2群體粒形性狀的相關(guān)性分析

F2群體粒形性狀相關(guān)性分析結(jié)果(表2)表明，千粒質(zhì)量與粒長、粒寬、長寬比均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.815，0.491和0.701。說明控制粒長和粒寬的大小能夠影響千粒質(zhì)量，且粒長對千粒質(zhì)量的影響更明顯。

表2 水稻F2群體粒形性狀間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation coefficient of grain shape traits in rice F2 population

2.3 水稻F2群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL定位

通過對1 558對SSR標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性篩選，共篩選出156對在親本間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，占引物總數(shù)的10.16%。選擇條帶清晰、多態(tài)性明顯的124對SSR標(biāo)記進(jìn)行F2群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，該連鎖圖譜覆蓋水稻全基因組4 255 cM，標(biāo)記間的平均距離為34.29 cM；其中每個標(biāo)記間的最大遺傳距離為50 cM，最小遺傳距離為1.4 cM，覆蓋水稻12對染色體(圖2)。

圖2 水稻F2群體的遺傳連鎖圖譜Fig.2 Linkage genetic map of rice F2 population

通過對粒長、粒寬、長寬比和千粒質(zhì)量進(jìn)行QTL分析，結(jié)果見表3。由表3可以看出，本研究共檢測到17個與粒形性狀有關(guān)的QTL位點，分別位于水稻第2、3、4、5、9、10號染色體，單個QTL位點的貢獻(xiàn)率為4%～18%。其中6個與粒長相關(guān)的QTLs分別位于水稻第2、4、5號染色體上，單個標(biāo)記貢獻(xiàn)率為4%～11%，以2號染色體上qGL-2-1的貢獻(xiàn)率最大(11%)，其可能為控制粒長的主效QTL位點；qGL-2-1位點的加性效應(yīng)為負(fù)值，其增效等位基因來源于大粒稻。3個與粒寬相關(guān)的QTLs(qGW-2-1、qGW-2-2、qGW-2-3)均位于水稻第2號染色體上，貢獻(xiàn)率分別為6%，11%和12%，加性效應(yīng)均為負(fù)值，其QTL位點的增效等位基因均來自于大粒稻；2個貢獻(xiàn)率大于10%的位點為qGW-2-2和qGW-2-3，可能也屬于主效QTL位點。5個與長寬比相關(guān)的QTLs分別位于水稻第2、3、5號染色體，即qL/W-2-1、qL/W-2-2、qL/W-3-1、qL/W-5-1、qL/W-5-2，其QTL位點貢獻(xiàn)率分別為18%，5%，5%，4%和6%；其中qL/W-2-1位點的貢獻(xiàn)率最大，可能為主效QTL位點。3個與千粒質(zhì)量相關(guān)的QTL分別位于水稻第2、9、10號染色體上，貢獻(xiàn)率分別為5%，4%和8%，加性效應(yīng)分別為0.12，-0.52和1.63，其中2個QTL增效等位基因來源于東北小粒種，1個QTL增效等位基因來源于大粒稻。

表3 水稻F2群體粒形性狀的QTL定位結(jié)果Table 3 QTL mapping of grain shape traits in rice F2 population

3 討 論

3.1 水稻粒形性狀的相關(guān)性

目前，提高水稻產(chǎn)量是科研工作者面臨的一大挑戰(zhàn)，而水稻產(chǎn)量與籽粒大小有著密切關(guān)系。粒形的粒長、粒寬、長寬比和千粒質(zhì)量4個性狀之間相互影響。梅德勇[23]研究發(fā)現(xiàn),水稻粒長和粒寬均與千粒質(zhì)量呈正相關(guān)關(guān)系。石春海等[24]研究表明，粒長與千粒質(zhì)量呈顯著正相關(guān)。呂勇[25]研究發(fā)現(xiàn)，水稻的千粒質(zhì)量與粒長、粒寬、粒厚等均呈顯著正相關(guān)。本研究通過對水稻F2群體內(nèi)粒形性狀間進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)粒長、粒寬和千粒質(zhì)量3個性狀兩兩間均呈極顯著正相關(guān)，表明粒長和粒寬能夠影響千粒質(zhì)量，這與前人的研究結(jié)果存在一定相似性。

3.2 水稻粒形性狀的QTL定位

水稻粒形是一個由多基因控制的數(shù)量性狀，易受環(huán)境影響。目前已報道了600多個與粒形有關(guān)的QTLs，其中136個與粒長有關(guān)、139個與粒寬有關(guān)、74個與長寬比有關(guān)、220個與千粒質(zhì)量有關(guān)[22]。隨著水稻基因組測序和功能基因組學(xué)的發(fā)展，將有更多的粒形基因會被定位和克隆，對其調(diào)控機(jī)理研究也會越來越多。目前已克隆的基因?qū)λ玖Ｐ蔚谋憩F(xiàn)具有重要的調(diào)節(jié)作用，相關(guān)基因調(diào)控水稻粒形的方式也很多，主要有轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、G蛋白途徑以及通過調(diào)控激素水平控制粒形等[26]。

趙錦龍等[5]鑒定到15個與粒形性狀有關(guān)的QTL，包括3個粒長QTL、4個粒寬QTL、3個長寬比QTL、5個千粒質(zhì)量QTL，且有6個QTL位點與前人研究相同或相近，另外9個QTL可能為新位點。汪欲鵬等[27]檢測到5個粒長QTL、9個粒寬QTL、8個粒厚QTL，且5個可能為影響粒形的新QTL位點。呂勇[25]共定位到33個與粒形有關(guān)的QTL，影響粒長、粒寬、粒厚、千粒質(zhì)量的QTL個數(shù)分別為6，10，8和9，其中qGL3-3、qGW2-1、qGT2、qGT5已報道。張亞東等[28]利用2年的數(shù)據(jù)，共鑒定到25個影響粒形的QTL，新位點為qGW9、qGT2.2和qGT9。上述研究結(jié)果表明本試驗研究的可行之處，挖掘控制粒形的新QTL能夠?qū)λ玖Ｐ位虻难芯坑兴鶐椭?/p>

3.3 QTLs功能的可行性

本研究發(fā)現(xiàn)的QTL位點中，有些已經(jīng)被報道或克隆，如檢測到的位于第2號染色體RM1347、RM145、RM5699上的位點qGW-2-1、qGW-2-2和qGW-2-3與張亞東等[28]檢測到位于RM1347-RM5699區(qū)間上的位點qGW2.2的區(qū)間相同或相近，且Song等[13]在相似的區(qū)域內(nèi)克隆了粒寬基因GW2。Wu等[29]克隆出控制粒長的基因GL4，位于第4號染色體上RM3335-RM5608區(qū)間，與本研究檢測到控制粒長的QTL位點不在同一區(qū)間，說明本研究檢測到的4個QTL位點可能為新位點；Fan等[30]克隆的控制粒長和千粒質(zhì)量的GS3、Weng等[15]克隆的控制粒寬和千粒質(zhì)量的基因GW5與本研究所檢測到qL/W-3-1、qGL-5-1、qL/W-5-1、qL/W-5-2是否為同一基因或等位基因，有待于進(jìn)一步功能驗證。qGL-2-1、qGL-4-1、qGL-4-2、qGL-4-3、qGL-4-4、qTGW-2-1、qTGW-9-1、qTGW-10-1等8個QTL位點在相應(yīng)的區(qū)間尚未見報道，可能是新位點，后續(xù)試驗將繼續(xù)構(gòu)建群體，對其進(jìn)行驗證和精細(xì)定位。說明利用大粒形和小粒形材料能定位到多個調(diào)控粒形的位點，這有助于研究粒形對水稻產(chǎn)量的影響。

4 結(jié) 論

本研究共檢測到17個與粒形有關(guān)的QTLs，與粒長、粒寬、長寬比和千粒質(zhì)量有關(guān)的QTL分別為6，3，5和3個，位于水稻第2、3、4、5、9、10號染色體上。貢獻(xiàn)率大于5%的QTLs有8個。有多個QTLs被重復(fù)檢測到，第2號染色體上RM5764附近的qGL-2-1和qTGW-2-1，分別控制粒長和千粒質(zhì)量；第2號染色體上RM145、RM5699附近的qGW-2-2、qGW-2-3與qL/W-2-1、qL/W-2-2，前2個控制籽粒寬度，后2個控制籽粒長寬比；第5號染色體上RM3351附近的qGL-5-1與qL/W-5-2，分別控制粒長和長寬比，說明檢測到的QTLs具有穩(wěn)定性。試驗中檢測到可能為控制粒形的新位點，將會在下一步試驗中進(jìn)行驗證，且對確定的新位點進(jìn)行精細(xì)定位。