中國(guó)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病GATA3基因單核苷酸多態(tài)性與預(yù)后的相關(guān)性研究

陳瀟瀟， 王 翔， 李本尚， 胡文婷， 陳長(zhǎng)城， 沈樹(shù)紅， 陳 靜， 薛惠良， 湯靜燕， 湯燕靜

在B細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)患兒中，約有15%遺傳表達(dá)特征與費(fèi)城染色體陽(yáng)性的急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)相似，稱之為Ph樣ALL，且Ph樣ALL的患兒往往有較高的復(fù)發(fā)率。這類亞型的ALL在淋巴細(xì)胞發(fā)育活化、細(xì)胞因子受體、激酶信號(hào)傳導(dǎo)路徑等方面都有遺傳結(jié)構(gòu)改變，特別與體細(xì)胞IKZF1基因的缺失或突變密切相關(guān)，往往伴有CRLF2基因重排和JAK2突變[1～5]。研究[6]表明，轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)是參與調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞分化的一個(gè)重要因子，在造血干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞早期發(fā)育階段發(fā)揮著重要作用。St. Jude兒童研究醫(yī)院的Yang等研究顯示，GATA3基因的SNP位點(diǎn)rs3824662與Ph樣ALL高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其純合子基因型A/A的患兒早期治療反應(yīng)不良且復(fù)發(fā)率高。研究同時(shí)指出，A/A基因型患兒發(fā)生體細(xì)胞JAK突變、CRLF2重排和IKZF1缺失的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于C/C基因型和A/C雜合型，因此，GATA3的遺傳性變異與Ph樣ALL及其不良預(yù)后有關(guān)[7，8]。A/A基因型常見(jiàn)于西班牙裔美國(guó)人以及其他高印第安人血統(tǒng)的個(gè)體中，Migliorini[9]和Walsh[10]等相繼報(bào)道了rs3824662 A/A基因型在歐洲西班牙裔ALL中的不良預(yù)后，而一組來(lái)自埃及的研究[11]也得出了相似的結(jié)果，但是罕見(jiàn)中國(guó)漢族兒童的相關(guān)報(bào)道。我們通過(guò)TaqMan探針熒光定量PCR法檢測(cè)入組SCMC-ALL-2005修正方案的患兒GATA3基因rs3781093和rs3824662兩個(gè)SNP位點(diǎn)，并統(tǒng)計(jì)分析其與ALL早期治療反應(yīng)、復(fù)發(fā)率與預(yù)后之間的關(guān)系，探討SNP位點(diǎn)不同基因型對(duì)ALL療效、預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1資料來(lái)源 選取2009-05～2014-12在上海兒童醫(yī)學(xué)中心明確診斷并接受治療的678例ALL患兒?；純悍謩e來(lái)自上海、浙江、江蘇、安徽、福建、江西等省份，均為漢族。入選標(biāo)準(zhǔn)：初診病例，未經(jīng)過(guò)任何相關(guān)治療；就診時(shí)年齡≤18歲；符合ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]；家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人同意患兒接受SCMC-ALL-2005修正方案治療，并簽署知情同意書(shū)；愿意接受長(zhǎng)期隨訪；除外成熟B-ALL。標(biāo)本來(lái)源于患兒疾病緩解期的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，抽提基因組DNA。本研究通過(guò)本中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(上海兒童醫(yī)學(xué)中心急性淋巴細(xì)胞白血病2005 & 2009方案，倫理批號(hào)：SCMCIRB-J201400)。

1.2分組標(biāo)準(zhǔn)與治療方案 SCMC-ALL-2005修正方案分組標(biāo)準(zhǔn)、治療方案和流程見(jiàn)本中心既往發(fā)表文章[13]。

1.3治療反應(yīng)和分子生物學(xué)預(yù)后相關(guān)因素檢測(cè) 所有初發(fā)患兒腫瘤細(xì)胞完善下列相關(guān)分子生物學(xué)檢測(cè)：real-time PCR檢測(cè)t(4；11)、t(9；22)、t(1；19)、t(12；21)融合基因，熒光原位免疫雜交法(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測(cè)斷裂點(diǎn)簇集區(qū)/Abelson白血病病毒(breakpoint cluster region-Abelson gene，BCR/ABL)融合基因、混合系白血病基因(mixed lineage leukemia，MLL)。所有患兒在誘導(dǎo)緩解第35天完善骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)MRD作為早期治療反應(yīng)評(píng)估[14]。

1.4方法 收集入組兒童緩解期骨髓樣本，分離單個(gè)核細(xì)胞，采用DNA提取試劑盒(QIAGEN)抽提基因組DNA。TaqMan? MGB probes,FAMTMand VIC? dye labeled探針購(gòu)自ABI公司(Catalog Number 4351379)，按照下列表1配置5 μl體系，在ABI PRISM 7900HT儀器內(nèi)設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。利用Sanger測(cè)序驗(yàn)證TaqMan探針?lè)z測(cè)結(jié)果：2個(gè)SNPs位點(diǎn)的3種不同基因型，每種基因型各取10份基因組DNA(引物序列rs3781093：5′-TTCCTGTGCTCTGTTCCTT；rs3824662：5′-TATCACCCTCCCCACCA)送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行Sanger單向測(cè)序。

表1 TaqMan探針熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件方差分析計(jì)算等位基因頻率分布Hardy-Weinberg平衡定律;運(yùn)用SHEsis程序(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)計(jì)算2個(gè)SNPs(rs3781093、rs3824662)之間的連鎖不平衡程度，即Lewontin系數(shù)(D′)和相關(guān)系數(shù)的平方(r2)。治療中患兒與醫(yī)務(wù)人員失去聯(lián)系>6個(gè)月定義為失訪，失訪者以失訪時(shí)疾病狀態(tài)統(tǒng)計(jì)。無(wú)復(fù)發(fā)生存(relapse-free survival，RFS)從治療起始日計(jì)算，統(tǒng)計(jì)終點(diǎn)為復(fù)發(fā)。未失訪者其隨訪日期截至2020-07-01。應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；RFS估計(jì)采用Kaplan-Meier生存分析法、log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般資料 入組SCMC-ALL-2005修正方案并可獲取樣本和臨床資料的患兒共678例，其中男性411例，女性267例；中位年齡4.86歲(0.25～16.65歲)。所有患者隨訪至2020-07-01，中位隨訪時(shí)間為76個(gè)月(1.2～126個(gè)月)。

2.2TaqMan探針PCR方法檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖1。

本圖為部分樣本rs3781093檢測(cè)結(jié)果，藍(lán)點(diǎn)為FAM熒光即T/T基因型，紅色為VIC熒光即C/C基因型，綠色為T(mén)/C雜合型，黑色×為空白對(duì)照。

2.3Sanger測(cè)序驗(yàn)證TaqMan探針PCR法結(jié)果 60份標(biāo)本測(cè)序結(jié)果與TaqMan探針?lè)ㄒ恢?。?jiàn)圖2。

?為C/C型；?為T(mén)/T型；?為T(mén)/C雜合型

2.4GATA3 SNP位點(diǎn)rs3781093和rs3824662檢測(cè)結(jié)果 678份樣本中，檢測(cè)到rs3781093位點(diǎn)基因型T/T共263例，基因型T/C共305例，基因型C/C共110例，C位點(diǎn)的等位基因頻率為38.8%(χ2=1.834，P=0.175)。按照Hardy-Weinberg平衡定律，符合Hardy-Weinbery遺傳平衡法則(P>0.05)，說(shuō)明本組能代表一般中國(guó)漢族人群。rs3824662位點(diǎn)的檢測(cè)中，基因型A/A共106例，基因型A/C共308例，基因型C/C共264例，A位點(diǎn)的等位基因頻率為38.3%(χ2=1.046，P=0.307)，提示群體基因遺傳平衡，樣本來(lái)自同一蒙德?tīng)柸后w。兩個(gè)SNPs位于10號(hào)染色體GATA3基因內(nèi)含子區(qū)域，通過(guò)SHEsis程序進(jìn)行連鎖不平衡分析，D′和r2分別為0.991和0.965，表明這兩個(gè)SNPs之間存在高度連鎖不平衡性。見(jiàn)圖3。

圖3 rs3781093和rs3824662連鎖不平衡分析圖

2.5rs3781093和rs3824662 SNP與預(yù)后的關(guān)系 678例患者中，共有158例復(fù)發(fā)，中位復(fù)發(fā)時(shí)間為24.1個(gè)月。在rs3781093位點(diǎn)，各基因型復(fù)發(fā)數(shù)分別為T(mén)/T型55例，T/C型73例，C/C型30例。見(jiàn)表2。T/T基因型患兒的5年RFS為(77.6±2.7)%，T/C基因型為(75.6±2.6)%，C/C基因型為(69.2±4.8)%，三者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.577，P=0.276)。見(jiàn)圖4。在rs3824662位點(diǎn)，各基因型復(fù)發(fā)數(shù)分別為A/A型29例，A/C型74例，C/C型55例。見(jiàn)表2。C/C基因型患兒的5年RFS為(77.7±2.7)%，A/C基因型為(74.9±2.5)%，A/A基因型為(69.1±4.9)%，三者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.773，P=0.250)。見(jiàn)圖4。

圖4 rs3781093及rs3824662不同基因型無(wú)復(fù)發(fā)生存率圖

2.6rs3781093和rs3824662 SNP與治療早期反應(yīng)的關(guān)系 本研究取誘導(dǎo)第35天MRD為評(píng)估治療早期反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，其中629例患兒有流式細(xì)胞術(shù)或融合基因的MRD標(biāo)記，分析顯示如下：629例患兒中，rs3781093位點(diǎn)T/T基因型242例，MRD≥0.01%有81例(33.5%)；T/C基因型291例，MRD≥0.01%有118例(40.5%)；C/C基因型96例，MRD≥0.01%有46例(47.9%)。C/C基因型患兒D35-MRD陽(yáng)性率高于其他兩種基因型患兒(χ2=6.614，P=0.037)。在rs3824662位點(diǎn)，A/A基因型患兒D35-MRD陽(yáng)性率高于其他兩種基因型患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.581，P=0.023)。見(jiàn)表2。

2.7rs3781093和rs3824662 SNP在細(xì)胞亞型及各危險(xiǎn)度分組中的分布 678例患兒中，兩SNP位點(diǎn)各基因型在B-ALL和T細(xì)胞型ALL(T-ALL)中的分布均相似(rs3781093，χ2=0.410，P=0.815；rs3824662，χ2=0.430，P=0.807)。678例患者中，低危組235例，中危組157例，高危組240例，超高危組46例。rs3781093位點(diǎn)C/C基因型相對(duì)在中高危組中分布更多，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.092，P=0.086)。在rs3824662位點(diǎn)結(jié)果也是類似的，A/A基因型相對(duì)在中高危組中分布更多，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.214，P=0.057)。見(jiàn)表2。

表2 678例ALL患兒SNP rs3781093和rs3824662各基因型與疾病分組、治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)的關(guān)系[n(%)]

3 討論

3.1與Ph陽(yáng)性ALL類似，Ph樣ALL是一組具有高度遺傳學(xué)異質(zhì)性的疾病，且單純傳統(tǒng)化療治療復(fù)發(fā)率高，早期篩選出該亞型ALL患兒并給予相應(yīng)強(qiáng)度的化療和靶向治療方案很重要[15]。除了篩查Ph樣ALL相關(guān)的基因如IKZF1、PAX5、JAK2、ABL和JAK激酶通路的融合基因等，美國(guó)St. Jude兒童研究醫(yī)院和歐洲及埃及部分協(xié)作組發(fā)現(xiàn)GATA3的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs3781093和rs3824662與Ph樣ALL相關(guān)，其中rs3824662的純合子基因型A/A的患兒早期治療反應(yīng)不佳且復(fù)發(fā)率高。

3.2GATA3是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，是血小板生成早期階段的必要因子。GATA3既與T淋巴細(xì)胞系分化密切相關(guān)，如在促進(jìn)Th2細(xì)胞分化的同時(shí)抑制Th1細(xì)胞的分化[16]，也與B細(xì)胞發(fā)育相關(guān)，抑制GATA3轉(zhuǎn)錄對(duì)早期B細(xì)胞定向分化是必要的[17]。GATA有一個(gè)類固醇激素受體超家族C4鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合基序，GATA3不僅可以直接結(jié)合至相應(yīng)DNA序列來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，還可通過(guò)染色質(zhì)重塑來(lái)改變基因的遺傳性狀。IKZF1基因編碼的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白IKAROS(IK)是重要的造血轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，GATA3在淋巴細(xì)胞中與IK相互作用，輔助IK調(diào)節(jié)造血細(xì)胞特異基因的轉(zhuǎn)錄，是造血細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制。IK的顯性負(fù)異構(gòu)體(IK4和IK6)在惡性造血細(xì)胞中經(jīng)常過(guò)表達(dá)，且與GATA相互作用的效率較IK低，這可能會(huì)破壞IK-GATA因子相互作用從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

3.3rs3781093和rs3824662的SNP都位于10號(hào)染色體的GATA3基因內(nèi)含子上(hg18：8141933，8144214)，等位基因型分別為C/T和A/C。因?yàn)樗拗鬟z傳多態(tài)性具有種族差異，既往國(guó)外的研究報(bào)道涉及亞洲人種尤其中國(guó)漢族兒童罕見(jiàn)，本中心SCMC-ALL-2005修正方案入組了近700例ALL病例，可獲得的基因組DNA有678例，樣本量較大。國(guó)外研究報(bào)道，歐洲、拉丁裔和亞洲人群的這兩個(gè)SNPs有強(qiáng)烈連鎖不平衡性，而非洲裔人群則顯示兩者不相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示患兒的rs3781093和rs3824662有強(qiáng)烈的連鎖不平衡性(D′=0.991,r2=0.965)，故以下分析討論皆以rs3824662為例。但是我們對(duì)中國(guó)漢族兒童ALL的研究結(jié)果與Yang及Gabriele等學(xué)者研究的結(jié)果[9]并不一致。與Ph樣ALL高度相關(guān)的SNP rs3824662的A/A基因型復(fù)發(fā)率并不高于C/C型和A/C雜合型；與ALL患兒的無(wú)復(fù)發(fā)生存率也無(wú)相關(guān)性，5年RFS相對(duì)偏低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同樣值得關(guān)注的是，按照SCMC-ALL-2005修正方案的危險(xiǎn)度分組方法，本研究中分布于中、高危組的A/A基因型患兒相對(duì)高于其他兩種基因型；并且誘導(dǎo)治療第35天MRD陽(yáng)性率也顯著高于A/C型和C/C型。Zhang等[18]的研究也提示rs3824662與ALL誘導(dǎo)緩解期治療反應(yīng)相關(guān)。我們考慮出現(xiàn)這種結(jié)果與本方案將第35天MRD檢測(cè)結(jié)果作為危險(xiǎn)度分組依據(jù)有關(guān)。多組大宗研究顯示，兒童ALL治療過(guò)程中任何時(shí)間點(diǎn)MRD≥0.01%患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高；誘導(dǎo)緩解化療結(jié)束時(shí)的MRD陽(yáng)性常提示預(yù)后不良。因此同許多協(xié)作組一樣，SCMC-ALL-2005修正方案將誘導(dǎo)化療結(jié)束時(shí)MRD是否轉(zhuǎn)陰作為危險(xiǎn)度分組的主要參考因素之一，并由此決定后續(xù)化療的強(qiáng)度。美國(guó)St.Jude兒童研究醫(yī)院的一項(xiàng)回顧性研究顯示，Ph樣ALL兒童不良預(yù)后可以在基于誘導(dǎo)緩解治療中和治療末MRD水平的危險(xiǎn)度分組分層治療下逆轉(zhuǎn)。St. Jude XV方案危險(xiǎn)度分組依據(jù)與SCMC-ALL-2005修正方案相似，將誘導(dǎo)治療第19天和誘導(dǎo)結(jié)束的MRD水平作為分組依據(jù)，而結(jié)果表明Ph樣ALL在這兩個(gè)治療時(shí)間點(diǎn)的MRD明顯高于非Ph樣ALL組，因此這部分患兒被納入更高危險(xiǎn)度組接受更強(qiáng)烈的化療，并且遠(yuǎn)期治療效果并不差[19]。本研究雖然沒(méi)有檢測(cè)IKZF1、PAX5和JAK2等基因畸變及ABL和JAK激酶通路的相關(guān)融合基因，定義Ph樣ALL并將其作為分組依據(jù)，但是在初診時(shí)危險(xiǎn)度分組的基礎(chǔ)上將誘導(dǎo)治療第35天時(shí)MRD≥0.01%的病例升入更高一級(jí)的危險(xiǎn)度組，接受相對(duì)更強(qiáng)的化療，因此，本研究中rs3824662位點(diǎn)的A/A基因型的無(wú)復(fù)發(fā)生存率與遠(yuǎn)期療效并不劣于A/C基因型和C/C基因型可能與此密切相關(guān)。

綜上所述，中國(guó)ALL患兒的GATA3基因rs3781093和rs3824662位點(diǎn)間存在高度連鎖不平衡，rs3781093位點(diǎn)的C/C基因型和rs3824662位點(diǎn)的A/A基因型與早期治療反應(yīng)不佳相關(guān)，但未顯著影響遠(yuǎn)期無(wú)復(fù)發(fā)生存率，這可能與治療方案中依據(jù)誘導(dǎo)緩解結(jié)束后MRD水平相應(yīng)強(qiáng)化治療有關(guān)。