傳統(tǒng)工藝釀造醬油微生物多樣性與風味研究

鄧岳，楊陽，梁麗靜，遲原龍，孫群

(1.瀘州職業(yè)技術學院，四川 瀘州 646000；2.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000；3.四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610064；4.四川大學 生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都 610064)

中國醬油生產(chǎn)歷史悠久，因其獨特的風味和營養(yǎng)價值備受全球人民青睞[1]。傳統(tǒng)醬油釀造采用的是長周期開放式的釀造工藝，釀造過程中涉及到自然界眾多微生物菌系的參與，同時也受區(qū)域性溫度、濕度等環(huán)境因素影響，因而擁有獨特的風味[2]。

四川省瀘州市先市鎮(zhèn)的釀造歷史最早可以追溯到漢朝，到唐朝時期已形成一套獨特的釀制體系，擁有一家歷時100多年的醬油老廠房和600多口百年以上的曬露缸，生產(chǎn)醬油采用手工作坊式的天然多菌種混合發(fā)酵工藝，在自然環(huán)境中日曬夜露3～5年，所產(chǎn)醬油具有獨特風味和顯著的區(qū)域特色。該釀造技藝于2014年被列入中國“非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”名錄進行重點保護，其生產(chǎn)場所也被列為“四川重點文物保護單位”名錄。

傳統(tǒng)釀造醬油采用自然開放式發(fā)酵，微生物種類和數(shù)量繁多，發(fā)酵過程涉及到多種有益微生物的聯(lián)合協(xié)同作用，通過微生物發(fā)酵糖類產(chǎn)生小分子醇類、醛類、酸類、酯類、酚類等風味物質(zhì)，這是醬油風味產(chǎn)生的主要途徑[3]。研究通過對傳統(tǒng)工藝釀制醬油發(fā)酵過程中微生物數(shù)量和種類與產(chǎn)品風味特征物質(zhì)進行分析，探究傳統(tǒng)工藝釀造醬油風味特征與微生物之間的聯(lián)系，明確傳統(tǒng)工藝發(fā)酵醬油風味物質(zhì)重要貢獻微生物，為分離風味貢獻菌株、提升醬油風味品質(zhì)與工藝優(yōu)化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品分別來自先市釀造發(fā)酵過程中的第0.5，1，2，3，4年，且不同年份的醬醅樣品選取采用隨機原則，均隨機取自5口不同的醬缸(N=25)，分別編號為0.5～4-1～5。樣品采集后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

各引物名稱、序列組成及文獻出處見表1，由Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成；細菌DNA提取試劑盒、酵母DNA提取試劑盒、植物DNA提取試劑盒、溶細胞酶(Lyticase)：北京天根公司；SYBR Green I：美國Sigma公司；Stool DNA Kit、Gel Extraction Kit：美國Omega公司；Premix Taq Version 2.0(loading dye mix)：日本Takara公司；D2000 DNA Marker。所有試劑均為分析純。

表1 用于本研究PCR的引物Table 1 The primers for PCR in this study

1.3 主要儀器設備

Wide Mini-Sub Cell GT型水平電泳槽；S1000型PCR儀；PowerPac Basic型電泳儀電源；Universal Hood II型凝膠成像系統(tǒng)；UV-2450紫外分光光度計、2010-plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；手動進樣器、固相微萃取頭、75 μm CAR/PDMS 美國Supelco公司。

1.4 微生物的分離與鑒定

1.4.1 分離培養(yǎng)培養(yǎng)基

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)：5 g蛋白胨、2.5 g酵母浸粉、1 g葡萄糖、15 g瓊脂粉，補水至1 L，調(diào)節(jié)pH至7，滅菌。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：300 g土豆，洗凈去皮切成小塊，加適量水煮沸20 min。用8層紗布過濾，濾液加入20 g葡萄糖、18 g瓊脂粉并補水至1 L，加熱使其充分溶解，滅菌。在倒平板之前，需加入用少量乙醇溶解的0.1 g氯霉素，0.22 μm濾膜過濾到冷卻至50 ℃左右的培養(yǎng)基中。

De Man, Rogosa, Sharpe瓊脂培養(yǎng)基(MRSA)：10 g 蛋白胨、10 g牛肉膏、5 g酵母浸粉、20 g葡萄糖、2 g K2HPO4、2 g檸檬酸銨、5 g乙酸鈉、0.58 g MgSO4· 7H2O、0.25 g MnSO4·4H2O、1 mL吐溫80、15 g瓊脂粉，補水至1 L，滅菌。

1.4.2 菌株的分離和鑒定

根據(jù)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和初步鏡檢觀察，最大程度地隨機挑選不同的特征菌落，然后進行反復的分離純化后，進行擴大培養(yǎng)。待擴大培養(yǎng)完成后，利用相應的DNA提取試劑盒提取部分菌株DNA，并使用針對16S rDNA的通用引物對27 F/1492 R(細菌)或針對ITS rDNA的通用引物對ITS1/ITS4(真菌)對相應目的基因序列進行擴增，擴增產(chǎn)物送Invitrogen公司進行測序以供菌種鑒定。

1.5 風味物質(zhì)的頂空固相微萃取

1.5.1 頂空固相微萃取條件

準確稱量8 mL傳統(tǒng)工藝釀制的先市醬油放置于頂空瓶中，加入1 g NaCl后密封，在40 ℃水浴鍋中平衡20 min，采用安裝有75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭的手動進樣器，對先市醬油中的風味物質(zhì)進行萃取，萃取時間為40 min。3個平行樣品，每個樣品手動進樣2次。

1.5.2 GC-MS條件[6-7]

樣品分別通過DP-5MS彈性石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行分離；程序升溫條件：起始溫度40 ℃，以3 ℃/min升到120 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升至250 ℃，保持2 min；載氣為高純氦氣(1.0 mL/min)；分流比10∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊電離(EI)離子源，電子能量70 eV；電子倍增器電壓350 V；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量范圍35～350 m/z；掃描速度3.00 scans/s。

通過計算機檢索，同時利用NIST 08和WILEY 09譜庫相互匹配進行定性分析。各組分相對含量按照峰面積歸一化法計算。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件的One-way ANOVA進行方差分析，并用LSD法和Dunnett＇s T3法進行事后兩兩比較分析，P≤0.05視為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 可培養(yǎng)微生物的主要類群計數(shù)

發(fā)酵醬醅中可培養(yǎng)的主要微生物類群計數(shù)結(jié)果見圖1。

圖1 醬醅中不同微生物類群隨發(fā)酵時間的變化

在整個醬醅發(fā)酵過程中，微生物(TMAB)的數(shù)量始終位居較高水平，菌落總數(shù)約為1×1010～1×1011CFU/g，在第一年這一時間點表現(xiàn)出小幅提升，并在第二年時略微下調(diào)，之后趨于平穩(wěn)；在數(shù)量水平上，細菌的芽孢與TMAB表現(xiàn)相似，不同的是前者數(shù)量的波動范圍更小，始終保持在1×1010CFU/g的水平；酵母的菌落總數(shù)在前兩年中相對穩(wěn)定，當發(fā)酵進行至中后期時下降了約兩個數(shù)量級。

2.2 可培養(yǎng)微生物的分離和鑒定

根據(jù)微生物菌落形態(tài)，共挑選61株細菌、18株酵母及12株霉菌進行分子鑒定，具體結(jié)果見表2，各菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫檢索得到的最相似模式菌株同源性均大于或等于99%。

表2 培養(yǎng)法獲得微生物的種類及所占比例Table 2 The types and proportion of microorganisms obtained by culture method

續(xù) 表

所有細菌菌落被鑒定為Bacillus屬，Bacillus優(yōu)勢顯著，主要為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌三類。根據(jù)黃永光等的研究結(jié)果，芽孢桿菌能產(chǎn)生高活性的胞外產(chǎn)物酶，同時也會分泌大量自身生長需求和代謝合成風味產(chǎn)物所需要的酶系，例如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纖維素酶、脂肪酶等水解酶在研究中均被發(fā)現(xiàn)，這些復雜的酶系為代謝的通路和初級代謝產(chǎn)物及其次生代謝產(chǎn)物的形成提供了關鍵動力。根據(jù)Quan C S等的研究表明[8]，芽孢桿菌屬在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生獨特的特征風味，呈現(xiàn)出辛香、甜香、蜂蜜香、醋酸香、油脂腐臭、奶酪香、水果香、芳香、醚香；奶油香、草莓果香、炒芝麻香、堅果香、青椒香、烤玉米香；玫瑰花香、杏仁香、異臭、略微氨臭味、醬香等特征性風味。

2.3 先市醬油揮發(fā)性風味物質(zhì)

傳統(tǒng)工藝釀造醬油HS-SPME氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖見圖2。

圖2 傳統(tǒng)工藝釀造先市醬油HS-SPME氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.2 GC/MS total ion chromatogram of Xianshi soy sauce brewed by traditional technology

由圖2可知，傳統(tǒng)工藝釀造的先市醬油中各種揮發(fā)性組分都取得了良好的分離效果，各色譜峰相應的質(zhì)譜圖經(jīng)人工解析及計算機檢索并結(jié)合相關文獻，共鑒定出48種風味化合物，其中醇類(8種)、酯類(7種)、醛類(7種)、酸類(6種)、酮類(6種)、吡嗪類(4種)、呋喃類(3種)、含硫化合物(3種)、酚類(2種)及其他類(2種)。

由表3可知，傳統(tǒng)工藝釀制醬油的風味成分中含量高的為酸類43%，醛類12%，呋喃類10%，醇類9%，其次為其他類、含硫類、酮類、吡嗪類、酯類。其中酸類物質(zhì)共有6種，其中以乙酸為主。有機酸可以通過酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等多種微生物以三羧酸或丙酮酸循環(huán)代謝生成，有機酸的存在能賦予醬油酸味柔和、回味綿長的口感；醛類物質(zhì)含量為12%，醛類物質(zhì)主要來源于不飽和脂肪酸的降解，含量較高的為2-甲基丁醛、異戊醛、5-甲基呋喃醛、苯乙醛。其中，苯乙醛具有焦糖香、甜以及類似蜂蜜的風味，呈咖啡和可可香氣，微帶甜的水果和巧克力似風味。醇類物質(zhì)占9%，其中以乙醇為主，一共檢出8種醇類物質(zhì)。以丁二醇為主，丁二醇是具有黃油和奶油香、甜味復雜的高級醇類化合物。酯類香味清淡，香味散逸快，逸散遠，容易讓人感覺到，在醬油中一共檢測出7種酯類物質(zhì)；雜環(huán)類化合物主要表現(xiàn)的是堅果香味和清香；吡啶類化合物、吡嗪類化合物具有強烈的水果香，其香氣閾值濃度極低，香氣透散性好；3種呋喃類香味物質(zhì)和4種吡嗪類化合物在醬油中被檢測出，其中以2,6-二甲基吡嗪為主；含硫化合物是含硫氨基酸經(jīng)過美拉德反應后通過Strecker降解產(chǎn)生，在火腿、烤肉中被檢測出，具有焦香、烤香、燒烤味，呈味閾值低，對產(chǎn)品風味影響大，一共檢測出3種含硫化合物，在醬油中含量為3%；其他類中檢測出2種，其中2-乙酰基吡咯具有烤面包香，為焦糖香化合物。

表3 傳統(tǒng)工藝釀制先市醬油風味物質(zhì)相對含量(%)Table 3 The relative content (%) of volatile components of Xianshi soy sauce brewed by traditional technology

許延濤等的研究表明[9]，芽孢桿菌屬可通過糖酵解、磷酸戊糖等一系列糖代謝途徑和檸檬酸循環(huán)；丙酮酸代謝等中間節(jié)點代謝、丙氨酸代謝、酪氨酸和苯甲酸降解羥化等氨基酸代謝途徑[10]；膦酸酯和膦酸代謝、硫胺素代謝、維生素B6代謝、核黃素代謝等其他途徑合成大量風味物質(zhì)，例如丙酮酸代謝途徑最終產(chǎn)物有乙醇、乙醛、乙酸、丙酮、丁醛、異丙醇、丁醇、丁酸等化合物；L-蘇氨酸代謝途徑產(chǎn)物合成吡嗪類化合物；苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝途徑產(chǎn)物為合成乙酸、丁酸等有機酸類物質(zhì)和苯乙醇、苯乙醛等風味化合物[11]；α-乙酰乳酸途徑合成丁二醇，代謝途徑合成醛類、酮類、吡嗪類、呋喃類風味物質(zhì)[12]，這與楊帆等研究得出從茅臺醬香型白酒生產(chǎn)大曲酒醅中分離產(chǎn)醬香風味的芽孢桿菌類功能菌發(fā)酵代謝風味物質(zhì)種類比較豐富，特別是吡嗪類、含硫化合物、醛類、酮類、酯類等種類和含量較高的結(jié)論一致，也與發(fā)酵過程中傳統(tǒng)工藝釀造醬油中微生物芽孢桿菌所占的種類、數(shù)量、比例的變化規(guī)律相吻合。

3 結(jié)論

為探究傳統(tǒng)工藝釀造醬油的微生物多樣性與風味特征品質(zhì)，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，分析傳統(tǒng)工藝釀造醬油中微生物的多樣性。結(jié)果顯示：在整個醬醅發(fā)酵過程中，微生物的數(shù)量始終居于較高水平，菌落總數(shù)約為1×1010～1×1011CFU/g，在第一年時間點表現(xiàn)出小幅提升，在第二年時略微下調(diào)，之后趨于平穩(wěn)；在數(shù)量水平上，細菌的芽孢與微生物總量表現(xiàn)相似，不同的是前者數(shù)量的波動范圍更小，始終保持在1×1010CFU/g的水平；酵母的菌落總數(shù)在前兩年相對穩(wěn)定，當發(fā)酵進行至中后期時下降了約兩個數(shù)量級；并從先市醬油發(fā)酵過程中分離出61株細菌、18株酵母及12株霉菌，其中芽孢桿菌主要有地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌三類。用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對其揮發(fā)性風味成分進行定性定量。從發(fā)酵4年的醬油中，共鑒定出48種風味化合物，其中醇類(8種)、酯類(7種)、醛類(7種)、酸類(6種)、酮類(6種)、吡嗪類(4種)、呋喃類(3種)、含硫化合物(3種)、酚類(2種)及其他類(2種)。Zhao X等的研究表明[13]，醬油中風味物質(zhì)產(chǎn)生機制與微生物組成分析表明，芽孢桿菌類微生物是先市醬油中酸類、酮類、含硫類、吡嗪類等低閾值化合物合成的重要微生物，芽孢桿菌屬可能對先市醬油獨特風味的形成起決定性作用。下一步從先市醬油中篩選出對醬油風味形成具有重要貢獻的芽孢桿菌，并將其優(yōu)化改良后用于現(xiàn)代工藝釀制醬油中改善風味不足、酒精味過重、產(chǎn)品質(zhì)量不高等問題[14]，從而提升現(xiàn)代工藝釀制醬油的風味和質(zhì)量。