陳璨，韓南南，劉洋，史曉維，司紅起，馬傳喜

小麥位點(diǎn)基因拷貝數(shù)的變異分析

陳璨，韓南南，劉洋，史曉維，司紅起，馬傳喜

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮南部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036

【】基因拷貝數(shù)變異是一種常見(jiàn)又重要的基因結(jié)構(gòu)變異，往往影響個(gè)體表型。低分子量麥谷蛋白（low-molecular-weight glutenin subunit，LMW-GS）是小麥貯藏蛋白的主要組成部分，位于位點(diǎn)。小麥作為異源六倍體，其龐大且復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)導(dǎo)致難以利用傳統(tǒng)方法檢測(cè)目的基因的拷貝數(shù)，針對(duì)小麥基因組，篩選可靠穩(wěn)定的內(nèi)參基因和體系，探索適合復(fù)雜基因組的拷貝數(shù)變異測(cè)定技術(shù)，測(cè)定位點(diǎn)LWM-GS基因拷貝數(shù)。以為內(nèi)參基因，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)參引物和探針，通過(guò)定性和定量PCR測(cè)定內(nèi)參基因在12個(gè)普通小麥品種中的拷貝數(shù)，分析該基因拷貝數(shù)在不同品種間的穩(wěn)定性；又以小麥品種篙優(yōu)2018的5個(gè)稀釋濃度的基因組DNA為模板，利用qRT-PCR驗(yàn)證內(nèi)參系統(tǒng)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性；根據(jù)位點(diǎn)LMW-GS基因序列設(shè)計(jì)特異性引物及探針，利用qRT-PCR和ddPCR 2種方法檢測(cè)8個(gè)小麥品種位點(diǎn)基因拷貝數(shù)，比較后選擇更優(yōu)的高通量基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法；再根據(jù)和位點(diǎn)LMW-GS基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物及探針，并利用ddPCR技術(shù)檢測(cè)和分析了231份小麥品種的、和位點(diǎn)上LMW-GS基因拷貝數(shù)。在12個(gè)普通小麥品種間、同一品種5個(gè)DNA稀釋濃度間的拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果一致，技術(shù)重復(fù)間的變異系數(shù)僅為0.07%—0.77%，所構(gòu)建的內(nèi)參系統(tǒng)穩(wěn)定；比較qRT-PCR和ddPCR 2種拷貝數(shù)檢測(cè)方法，8個(gè)品種所測(cè)的位點(diǎn)拷貝數(shù)結(jié)果一致，分別為3、5、3、4、3、3、3和3；且ddPCR檢測(cè)重復(fù)間的變異系數(shù)為0.30%—1.67%，遠(yuǎn)低于qRT-PCR的3.14%—12.72%，更加可靠；利用ddPCR對(duì)231份普通小麥品種的、和位點(diǎn)上LMW-GS基因拷貝檢測(cè)后分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)小麥品種在3個(gè)位點(diǎn)上的拷貝數(shù)為4，所占頻率分別為51.95%、32.03%和28.57%，位點(diǎn)總拷貝數(shù)變異范圍為10—21，變異系數(shù)為16.12%。內(nèi)參系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可以用作小麥位點(diǎn)和其他目的基因拷貝數(shù)檢測(cè)的內(nèi)參；qRT-PCR和ddPCR均可用于小麥基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，但后者更穩(wěn)定、可靠，且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)通量高。

小麥；低分子量麥谷蛋白；微滴式數(shù)字PCR；拷貝數(shù)變異

0 引言

【研究意義】小麥低分子量麥谷蛋白（low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS）約占貯藏蛋白的1/3[1]，其組成和結(jié)構(gòu)對(duì)小麥面粉品質(zhì)具有重要影響，尤其是面團(tuán)面筋強(qiáng)度，并決定面團(tuán)的粘彈性[2-3]。研究表明，LMW-GS的編碼基因大部分定位于小麥第一同源群染色體1A、1B和1D短臂近端粒處，依次被命名為、和位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)都包含著多個(gè)LMW-GS基因，構(gòu)成了非常復(fù)雜的LMW-GS基因家族[4-6]。LMW-GS基因的組成、拷貝數(shù)及其表達(dá)情況都影響著小麥品質(zhì)性狀[7-9]。但由于LMW-GS基因組成復(fù)雜，目前缺少有效的分離方法，很大程度上限制了對(duì)其拷貝數(shù)的研究。因此，探索和構(gòu)建高通量檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法尤為重要。【前人研究進(jìn)展】基因的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）是一種常見(jiàn)而又重要的基因結(jié)構(gòu)變異，一般認(rèn)為是由染色體重排等染色體結(jié)構(gòu)變異引起的，會(huì)導(dǎo)致基因組遺傳不穩(wěn)定，對(duì)個(gè)體性狀會(huì)產(chǎn)生一定的影響[10-11]。對(duì)于拷貝數(shù)的檢測(cè)，常用的技術(shù)主要包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、Sothern印跡雜交（southern blot）、短片段多重定量PCR（quantitative multiplex PCR of short fragments，QMPSF）以及數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)。20世紀(jì)末，Vogelstein等[12]提出了dPCR的概念，即將有限稀釋法、泊松分布和PCR技術(shù)聯(lián)合使用的新方法[13-14]。一種新的dPCR分析系統(tǒng)——微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR），用于檢測(cè)目的基因的拷貝數(shù)，可以使用熒光探針對(duì)2個(gè)靶基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，先使用微滴生產(chǎn)儀將一個(gè)樣本分成幾萬(wàn)份（>10 000），分配到不同的微滴單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝數(shù)的目標(biāo)分子（DNA模板），在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后利用微滴分析儀對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最后根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度[15-16]。在利用ddPCR進(jìn)行基因拷貝數(shù)檢測(cè)時(shí)需要一個(gè)已知的單拷貝或低拷貝基因作為內(nèi)參基因，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）是植物脂肪酸生物合成中的一種限速酶[17-19]。在禾本科作物基因組中，同時(shí)含有編碼質(zhì)體ACCase（）和胞質(zhì)ACCase（）的基因[20-21]，其中，被定位于2A、2B和2D染色體靠近端粒的短臂上，且Southern印跡雜交試驗(yàn)表明普通小麥中在每個(gè)染色體組都是單拷貝[22]。因此，可以作為檢測(cè)小麥中其他基因拷貝數(shù)的內(nèi)參基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于六倍體小麥為異源多倍體作物，其基因組龐大且復(fù)雜，利用傳統(tǒng)的Sothern印跡雜交等技術(shù)檢測(cè)小麥基因拷貝數(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且無(wú)法達(dá)到高通量測(cè)定要求?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬選擇適當(dāng)內(nèi)參基因，通過(guò)ddPCR技術(shù)構(gòu)建一種高通量、快速且穩(wěn)定的小麥基因拷貝數(shù)測(cè)定方法；并通過(guò)構(gòu)建的內(nèi)參體系和方法測(cè)定普通小麥位點(diǎn)LMW-GS基因拷貝數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

231份不同品種六倍體小麥秋播于合肥高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園試驗(yàn)站，每個(gè)材料種植2行，行長(zhǎng)2 m，行距25 cm，田間管理同大田管理。

1.2 內(nèi)參的選擇

構(gòu)建可靠的CNV檢測(cè)方法需要選擇特異性的DNA序列作為內(nèi)參基因，并且需要滿(mǎn)足3個(gè)要求：具有物種特異性，具有單個(gè)或穩(wěn)定的低拷貝數(shù)，以及不同品種之間拷貝數(shù)相同[23-24]。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，選擇作為內(nèi)參基因，從NCBI網(wǎng)站上下載已知序列，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，構(gòu)建內(nèi)參系統(tǒng)。

1.3 定性PCR條件

采用全式金生物公司的TransTaq?Hifi酶在T100TMThermal Cycler （BIO-RAD Laboratories，USA）熱循環(huán)儀進(jìn)行定性PCR分析，反應(yīng)體系為2.0 μl樣本DNA、0.5 μl上游引物（10 μmol·L-1）、0.5 μl下游引物（10 μmol·L-1）、2.0 μl dNTPs（2.5 mmol·L-1）、2.5 μl 10×Buffer、0.25 μl DNA酶，補(bǔ)加ddH2O至25 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min；95℃ 50 s，50—65℃ 30 s，72℃ 30s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 定量PCR條件

qRT-PCR采用愚公生命科技有限公司的Taq-HS Probe qPCR Premix，在CF×96TMReal-Time System（BIO-RAD Laboratories，USA）中進(jìn)行，反應(yīng)體系為2.0 μl樣本DNA、1.0 μl上游引物（10 μmol·L-1）、1.0 μl下游引物（10 μmol·L-1）、1.0 μl探針（10 μmol·L-1）和1.25 μl Taq-HS Probe qPCR Premix（10×），補(bǔ)加ddH2O至25 μl。qPCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 30 s，50—65℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的延伸階段采集熒光信號(hào)。參考Weng等[25]報(bào)道的絕對(duì)定量法來(lái)計(jì)算不同品種中目的基因拷貝數(shù)。

1.5 基因組DNA的酶切處理

采用NEB公司的HⅠ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切處理，50 μl的反應(yīng)體系包含1 μg基因組DNA、1 μlHⅠ限制性?xún)?nèi)切酶和5 μl 10×NE Buffer，補(bǔ)加ddH2O至50 μl。在37℃恒溫條件下反應(yīng)5 h，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 微滴式數(shù)字PCR分析基因拷貝數(shù)

先配制20×目的基因（或內(nèi)參基因）引物/探針混合液，包含目的基因（或內(nèi)參基因）上、下游引物（100 μmol·L-1）各18 μL和目的基因（或內(nèi)參基因）探針（100 μmol·L-1）5 μL，補(bǔ)加ddH2O至100 μL。再采用BIO-RAD公司的ddPCR Supermix for Probes（No dUTP）制備ddPCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系為10 μL 2×ddPCR Supermix for Probes（No dUTP）、1 μL 20×目的基因引物/探針混合液、1 μL 20×內(nèi)參基因引物/探針混合液和30 ng酶切后基因組DNA，補(bǔ)加ddH2O至20 μL。

隨后將反應(yīng)液通過(guò)QX200TM微滴發(fā)生器（QX200TMDroplet Generator, BIO-RAD Laboratories，USA）生成納升級(jí)別的油包水的液滴（理論上可形成20 000個(gè)微滴），緊接著轉(zhuǎn)移到96孔PCR板（Eppendorf, Germany）中，并利用熱封儀（PX1TMPCR Plate Sealer, BIO-RAD Laboratories，USA）進(jìn)行封膜。然后轉(zhuǎn)移到T100TMThermal Cycler（BIO-RAD Laboratories，USA）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 10 min；94℃ 30 s；50—65℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；98℃ 10 min；4℃保存待用，升降溫速度為2.0 ℃·s-1。

PCR擴(kuò)增完成后，將其轉(zhuǎn)移到QX200TM微滴分析儀（QX200TMDroplet Reader, BIO-RAD Laboratories，USA）對(duì)所有樣品孔進(jìn)行熒光檢測(cè)。最后利用QuantaSoft軟件（V1.3.10）對(duì)ddPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算每個(gè)樣品目的基因拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)參基因的選擇及其引物與探針的設(shè)計(jì)

通過(guò)查閱文獻(xiàn)搜索到低拷貝數(shù)的候選基因質(zhì)體乙酰輔酶A羧化酶基因（），在普通小麥中具有3個(gè)拷貝。從NCBI網(wǎng)站上下載已公布的序列，運(yùn)用DNAMAN生物軟件對(duì)下載的序列進(jìn)行序列對(duì)比，運(yùn)用Primer express3.0軟件在的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物（Acc1F和Acc1R）和探針（T-Acc1）（表1）。

表1 特異性引物和探針

2.2 定性和定量PCR檢測(cè)Acc1在不同六倍體小麥中的穩(wěn)定性

合適的內(nèi)參基因應(yīng)在同一物種的不同品種之間具有相同的拷貝數(shù)，為了檢測(cè)不同普通小麥品種之間拷貝數(shù)的種內(nèi)穩(wěn)定性，選取12個(gè)品種的普通小麥提取基因組DNA，每個(gè)品種各取30 ng DNA，以Acc1F、Acc1R為引物進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，不同品種之間獲得相同大小和等效強(qiáng)度的PCR產(chǎn)物，并且沒(méi)有顯示出非特異性的條帶（圖1），表明所設(shè)計(jì)的引物能夠穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出序列，特異性較高，并且普通小麥品種間拷貝數(shù)沒(méi)有明顯差異。

1：黔11240-2；2：鄭麥583；3：中麥14；4：德宏福麥2號(hào)；5：瑞泉麥168；6：中合-75；7：益科麥5號(hào)；8：內(nèi)麥836；9：陽(yáng)光838；10：安農(nóng)1020；11：新麥31；12：黔090304-4

選取12個(gè)不同品種小麥50 ng基因組DNA，以Acc1F、Acc1R為引物，T-Acc1為探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，定量PCR的結(jié)果顯示不同品種的小麥擴(kuò)增曲線(xiàn)極為相似，并且獲得的Ct值只有輕微的變異性（圖2），范圍為29.18—30.00，變異系數(shù)為1.03%，拷貝數(shù)在供試品種之間被認(rèn)為是相同的。

2.3 定量PCR檢測(cè)Acc1定量系統(tǒng)的重復(fù)性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證定量系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，選用篙優(yōu)2018的5個(gè)稀釋度的基因組DNA為模板，以Acc1F、Acc1R為引物，T-Acc1為探針進(jìn)行定量PCR（表2），結(jié)果表明，復(fù)孔間變異系數(shù)為0.07%—0.77%，SD值為0.0208—0.2100，由于這些值相對(duì)較小，因此，定量系統(tǒng)被認(rèn)為是穩(wěn)定且可靠的，可作為內(nèi)參基因來(lái)測(cè)定其他基因的拷貝數(shù)。

2.4 Glu-3位點(diǎn)LMW-GS基因的引物與探針設(shè)計(jì)及其特異性分析

從NCBI網(wǎng)站上下載已知的分別位于、和位點(diǎn)上的LMW-GS基因，通過(guò)對(duì)LMW-GS基因序列進(jìn)行比對(duì)，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物與探針（表1），其中，Glu-A3T、Glu-B3T和Glu-D3T探針的5′端、3′端所連的熒光集團(tuán)分別為5′-FAM和3′-BHQ1；T-Acc1探針的5′端、3′端所連的熒光集團(tuán)分別為5′-HEX和3′-BHQ1。

A：12個(gè)不同品種的內(nèi)參基因定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)；1：黔11240-2；2：鄭麥583；3：中麥14；4：德宏福麥2號(hào)；5：瑞泉麥168；6：中合-75；7：益科麥5號(hào)；8：內(nèi)麥836；9：陽(yáng)光838；10：安農(nóng)1020；11：新麥31；12：黔090304-4。B：12個(gè)不同普通小麥品種的Ct值

表2 內(nèi)參基因重復(fù)性檢測(cè)Ct值變化情況

從普通小麥近緣物種（烏拉爾圖小麥AA、一粒小麥AA、擬斯卑爾脫山羊草BB、節(jié)節(jié)麥DD和圓錐小麥AABB）及普通小麥AABBDD中國(guó)春、安農(nóng)0711中提取基因組DNA，分別用引物Glu-A3F/R、Glu-B3F/R、Glu-D3F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，Glu-A3F/R只能從含A基因組的材料中擴(kuò)增出目的基因，Glu-B3F/R只能從含有B基因組的材料中擴(kuò)增出目的基因，Glu-D3F/R只能從含D基因組的材料中擴(kuò)增出目的基因（圖3）。

2.5 2種拷貝數(shù)變異分析方法的比較

qRT-PCR與ddPCR均能對(duì)目的基因拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定，選用8個(gè)普通小麥品種，分別采用qRT-PCR和ddPCR 2種方法來(lái)測(cè)定普通小麥位點(diǎn)上的LMW-GS基因拷貝數(shù)。

以煙農(nóng)19全基因組DNA（1 066.71 ng·μL-1）為模板，稀釋成6個(gè)梯度，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)；以水作為空白對(duì)照，得出Ct值與DNA初始濃度的對(duì)數(shù)值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖4），并得到內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程（=-2.780+33.098，2=0.998，E=106.1%）和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程（=-2.823+33.993，2=0.998，E=108.9%），這兩個(gè)基因擴(kuò)增曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)（2）均接近1，且擴(kuò)增效率（E）也均接近于1，表明所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可以用于拷貝數(shù)的測(cè)定。

選取8個(gè)小麥品種的基因組DNA（濃度均為200 ng·μL-1），進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品3次重復(fù)，并且與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的樣品同時(shí)擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后得到8個(gè)樣品的Ct值（表3），結(jié)果顯示，8個(gè)小麥品種中拷貝數(shù)最高為5，最低為3，有6個(gè)品種的拷貝數(shù)為3，并且利用qRT-PCR測(cè)定時(shí)重復(fù)間的變異系數(shù)為3.14%—12.72%。

A：Glu-A3F/R引物檢測(cè)。1：中國(guó)春；2：一粒小麥；3：擬斯卑爾托山羊草；4：節(jié)節(jié)麥；5：烏拉爾圖小麥；6：水；7：安農(nóng)0711。B：Glu-B3F/R引物檢測(cè)。1：一粒小麥；2：節(jié)節(jié)麥；3：圓錐小麥；4：中國(guó)春；5：水。C：Glu-D3F/R引物檢測(cè)。1：烏拉爾圖小麥；2：擬斯卑爾托山羊草；3：節(jié)節(jié)麥；4：圓錐小麥；5：水

表3 8個(gè)不同樣品3次重復(fù)的Ct值及目的基因拷貝數(shù)變化情況

圖4 目的基因和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

采用ddPCR來(lái)測(cè)定上述8個(gè)不同小麥品種的拷貝數(shù)。限制性?xún)?nèi)切酶HⅠ酶切基因組DNA（濃度為200 ng·μL-1）后，再按照ddPCR操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，最后得出了8個(gè)品種的拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果（圖5），其中，安農(nóng)92484W拷貝數(shù)最高為5，小偃6號(hào)拷貝數(shù)為4，其余6個(gè)品種的拷貝數(shù)為3，且重復(fù)間的變異系數(shù)僅在0.30%—1.67%。

綜上所述，利用qRT-PCR和ddPCR 2種方法對(duì)8個(gè)樣品目的基因拷貝數(shù)的檢測(cè)結(jié)果是一致的，但是ddPCR重復(fù)間的變異系數(shù)要遠(yuǎn)低于qPCR，表明用ddPCR方法來(lái)測(cè)定基因拷貝數(shù)更穩(wěn)定、準(zhǔn)確。

1：煙農(nóng)15；2：安農(nóng)92848W；3：百農(nóng)64；4：小偃6號(hào)；5：周麥16；6：02P67；7：邯鄲6172；8：周麥18

2.6 微滴式數(shù)字PCR測(cè)定普通小麥Glu-3位點(diǎn)LMW-GS拷貝數(shù)

利用微滴式數(shù)字PCR對(duì)231份不同品種的普通小麥的、和位點(diǎn)LMW-GS基因分別進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)（電子附表1），對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（圖6），結(jié)果顯示，在231份材料中，大多數(shù)小麥品種的位點(diǎn)LMW-GS基因拷貝數(shù)為4，所占頻率51.95%，最高拷貝數(shù)為8，最低為3，不同品種間拷貝數(shù)變異系數(shù)為28.40%；大多數(shù)小麥品種的位點(diǎn)LMW-GS基因拷貝數(shù)為4，所占頻率為32.03%，拷貝數(shù)最高為9個(gè)拷貝，最低為3個(gè)拷貝，不同品種間拷貝數(shù)變異系數(shù)為29.30%；大多數(shù)小麥品種的位點(diǎn)LMW-GS基因拷貝數(shù)為4，所占頻率為28.57%，拷貝數(shù)最高為9個(gè)拷貝，最低為3個(gè)拷貝，不同品種間拷貝數(shù)變異系數(shù)為30.07%。

綜合、和3個(gè)位點(diǎn)的LMW-GS基因拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果，可以計(jì)算出小麥位點(diǎn)基因的總拷貝數(shù)（圖7）。結(jié)果顯示，在231份材料中，大多數(shù)小麥品種的位點(diǎn)LMW-GS基因拷貝數(shù)為12—18，所占頻率為85.90%，拷貝數(shù)最高為21，最低為10，不同品種間拷貝數(shù)變異系數(shù)為16.10%。

圖6 231份小麥品種Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)基因拷貝數(shù)頻數(shù)分布條形圖

圖7 231份小麥品種Glu-3位點(diǎn)基因拷貝數(shù)頻數(shù)分布條形圖

3 討論

微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)是近幾年迅速發(fā)展起來(lái)的第三代PCR技術(shù)，已被越來(lái)越多地應(yīng)用于生命科學(xué)研究中，比如致病微生物檢測(cè)[26]、稀有突變檢測(cè)[27]、基因表達(dá)分析[28]、基因拷貝數(shù)變異分析[29]等。在利用ddPCR來(lái)測(cè)定目的基因拷貝數(shù)時(shí)需要一個(gè)已知拷貝數(shù)的單拷貝或低拷貝基因作為內(nèi)參基因。一些研究以單拷貝的、和作為內(nèi)參基因來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小麥外源基因拷貝數(shù)[30]。而本研究所選擇的內(nèi)參基因?yàn)橘|(zhì)體乙酰輔酶A羧化酶（plastid ACCase）基因（）。Gornicki等[31]利用中國(guó)春缺四體材料將定位在了第二同源群2A、2B和2D染色體靠近端粒的短臂上，并利用Southen印跡雜交分析得出六倍體小麥中在每個(gè)染色體組都為單拷貝，因此，在六倍體小麥中有3個(gè)拷貝。作為內(nèi)參基因，還要求其在不同的品種中拷貝數(shù)是穩(wěn)定的，并且內(nèi)參基因的擴(kuò)增還要具有重復(fù)性。本研究借鑒Mayu等[32]的研究方法，用不同品種相同濃度的DNA驗(yàn)證了內(nèi)參基因拷貝數(shù)的穩(wěn)定性，并用相同品種不同濃度的DNA驗(yàn)證了內(nèi)參基因擴(kuò)增的可重復(fù)性。因此，本研究設(shè)計(jì)的內(nèi)參系統(tǒng)（Acc1F/R和T-Acc1）可作為檢測(cè)六倍體小麥中目的基因拷貝數(shù)的內(nèi)參引物和探針。

目前，研究植物基因拷貝數(shù)的方法有很多，但利用ddPCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)小麥目的基因拷貝數(shù)的報(bào)道很少。經(jīng)典的植物基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法主要有Southern印跡雜交和qRT-PCR 2種[33-34]。其中傳統(tǒng)的Sounthern印跡雜交技術(shù)對(duì)DNA樣品的質(zhì)量和純度有一定的要求，其試驗(yàn)周期長(zhǎng)，雜交步驟繁瑣，并且對(duì)試驗(yàn)技術(shù)條件要求較高；可能因存在等位基因，而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不能真實(shí)反映該基因的拷貝數(shù)；另外，試驗(yàn)中所用的探針標(biāo)記若采用同位素標(biāo)記，對(duì)人體健康和環(huán)境安全存在嚴(yán)重威脅[35]。qRT-PCR檢測(cè)方法的步驟較為繁瑣，其需要準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品，再利用標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立又需對(duì)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行不斷摸索與優(yōu)化，所需試驗(yàn)周期較長(zhǎng)[36]；借助標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量本身就是一種相對(duì)定量的方法，檢測(cè)結(jié)果可能不準(zhǔn)確[37]。而ddPCR作為一種新興的、準(zhǔn)確的絕對(duì)定量技術(shù)，與qRT-PCR相比，ddPCR的優(yōu)勢(shì)非常明顯，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面[38-39]：（1）靈敏度可達(dá)單個(gè)核酸分子，檢測(cè)限低至0.001%；（2）無(wú)需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可對(duì)DNA樣品進(jìn)行絕對(duì)定量；（3）終點(diǎn)PCR檢測(cè)，不依賴(lài)Ct值，不依賴(lài)擴(kuò)增曲線(xiàn)，特別適合基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測(cè)；（4）具有更好的準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性，可用于精確測(cè)定靶基因的拷貝數(shù)。本文以為內(nèi)參基因，通過(guò)qRT-PCR和ddPCR 2種技術(shù)對(duì)8個(gè)樣品的位點(diǎn)LMW-GS基因進(jìn)行拷貝數(shù)測(cè)定，結(jié)果基本一致，但ddPCR重復(fù)間的變異系數(shù)更小，且不依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在本研究中以為內(nèi)參基因，使用特異性引物和探針系統(tǒng)，采用ddPCR技術(shù)分別對(duì)231份普通小麥、和位點(diǎn)LMW-GS基因拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定，3個(gè)位點(diǎn)的基因拷貝數(shù)分別在3—9、4—9、4—9范圍內(nèi)，位點(diǎn)總拷貝數(shù)為10—21，這與前人通過(guò)Southen印跡雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)普通小麥的LMW-GS基因在總基因組中的拷貝數(shù)可能在10—15個(gè)和35—40個(gè)范圍內(nèi)基本相符[40-41]。

當(dāng)拷貝數(shù)可變區(qū)域的劑量敏感基因或涉及調(diào)控作用的基因發(fā)生拷貝數(shù)變異時(shí)，也會(huì)對(duì)表型產(chǎn)生顯著的影響[42-43]。關(guān)于基因拷貝數(shù)變異對(duì)表型的影響在一些植物性狀上已有不少報(bào)道。小麥矮稈基因（）由于拷貝數(shù)的增加而導(dǎo)致植株高度降低，其致矮能力是單拷貝的3倍多[44]。在大麥中，硼轉(zhuǎn)運(yùn)基因拷貝數(shù)的增加會(huì)使大麥Sahara具備硼毒性耐受性[45]。（C-重復(fù)結(jié)合因子）位于小麥和大麥的抗霜性位點(diǎn)2（），其拷貝數(shù)變異與低溫耐受性相關(guān)，冬小麥的拷貝數(shù)要高于春小麥，四倍體硬粒小麥和六倍體面包小麥的位點(diǎn)上大型基因的缺失（包括、和）會(huì)導(dǎo)致小麥耐寒性降低[46-49]。在小麥中隨著拷貝數(shù)的增加，會(huì)延長(zhǎng)小麥春化時(shí)間導(dǎo)致開(kāi)花推遲，而大麥中高拷貝數(shù)能夠加速開(kāi)花時(shí)間[50-51]。以上研究表明，某些基因的拷貝數(shù)變異對(duì)相應(yīng)的表型有著重要的影響。

小麥低分子量麥谷蛋白（LMW-GS）賦予面筋強(qiáng)度和延展性，在小麥的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和面粉加工品質(zhì)形成中具有重要影響[2-3]，已有大量研究表明LMW-GS基因的組成和表達(dá)量與小麥加工品質(zhì)密切相關(guān)，不同種質(zhì)的小麥含有的LMW-GS等位基因不同，其編碼的LMW-GS亞基組合不同，因此對(duì)小麥面粉品質(zhì)產(chǎn)生的影響也不同[7-9]。而關(guān)于位點(diǎn)LMW-GS基因拷貝數(shù)變異對(duì)小麥面粉品質(zhì)的影響還未有報(bào)道。本研究將測(cè)定的231份普通小麥的、和位點(diǎn)LMW-GS基因拷貝數(shù)與小麥4個(gè)品質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，除位點(diǎn)基因拷貝數(shù)與2012年小麥面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間和形成時(shí)間達(dá)到顯著負(fù)相關(guān)性外，其余均未達(dá)到顯著相關(guān)性，說(shuō)明位點(diǎn)的LMW-GS拷貝數(shù)多樣性不是影響上述小麥品質(zhì)性狀的主要原因。

4 結(jié)論

以為內(nèi)參基因，構(gòu)建了內(nèi)參系統(tǒng)（引物和探針），它在品種間和同一品種不同濃度間均具有穩(wěn)定性和重復(fù)性，可用于小麥和其他目的基因拷貝數(shù)研究。qRT-PCR和ddPCR均可用于小麥中特定基因或位點(diǎn)的拷貝數(shù)檢測(cè)，但相較于前者，ddPCR方法變異系數(shù)更低，且具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果更準(zhǔn)確、檢測(cè)通量高等優(yōu)點(diǎn)。

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Analysis of copy number variation oflocus in Common wheat

CHEN Can, HAN Nannan, LIU Yang, SHI XiaoWei, SI HongQi, MA ChuanXi

College of Agronomy, Anhui Agriculture University/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement on Southern Yellow & Huai River Valley, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hefei 230036

【】The variations in numbers of copies of a gene is a common and important gene structure variation, which often effects individual phenotype. Low-molecular-weight glutenin subunit (LMW-GS) located at theloci, is an essential part of storage protein in wheat. As a hetero-hexaploid, the huge and complex wheat genome makes it difficult to detect numbers of gene copies by classical methods. A limited information is available about CNV analysis of LWM-GS. To screen reliable and stable internal reference genes and systems for complex genome and explore the CNV determination technology suitable in different wheat varieties, the techniques used for detection of gene copy numbers, based on droplet digital PCR (ddPCR) which improve the detection flux of target gene and determine the particular numbers of gene copies ofloci.【】In this paper,was used as the internal reference gene. The internal reference primers and probes were designed by using the corresponding gene sequence. In order to analyze stability of numbers of copies ofqRT-PCR was used to analyze the repeatability and accuracy ofinternal reference system (primers and probes).The corresponding specific primers and probes were designed according to the LMW-GS gene sequence ofloci. Two different methods, qRT-PCR and ddPCR, were used to detect the numbers of copies ofloci in eight wheat varieties, in order to determine which method is more suitable for high-throughput detection ofloci gene. The specific primers and probes were also designed according to the sequences of LMW-GS gene atandloci. The numbers of copies of LMW-GS gene at,andloci of 231 varieties were determined and analyzed by ddPCR.【】The results showed that the gene copy numbers of Acc1 was consistent among varieties and different DNA concentrations of the same variety. The coefficient of variation (CV) between repeats was 0.07%-0.77%. It is also indicated from results that theinternal reference system constructed in this paper has good stability and repeatability. The results of qRT-PCR and ddPCR were consistent in detecting the numbers of copies of LMW-GS gene atloci in 8 wheat varieties, which were 3, 5, 3, 4, 3, 3, 3 and 3, respectively. However, the CV among repeats detected by ddPCR was 0.30%-1.67%, which much lower than that by qRT-PCR. It showed that using ddPCR method to detect the gene copy numbers ofloci gene is more stable and reliable. The numbers of copies of LMW-GS gene were 4 at,andhaving a frequency of 95%, 32.03% 28.57% respectively in 231 wheat varieties. The total variation range in numbers of copies ofwas 10-21, and the CV was 16.12%.【】With good stability and repeatability,could be used as internal reference gene for numbers of gene copies detection in wheat. Both qRT-PCR and ddPCR could be used in gene copy numbers detection with wheat genes, but the ddPCR is more simple, stable, reliable and has high detection flux.

wheat; low-molecular-weight glutenin subunit (LMW-GS); droplet digital PCR (ddPCR); copy number variation (CNV)

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.002

2020-07-28；

2020-09-27

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0100804，2016YFD0101802）、國(guó)家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)（CARS-03）、安徽高校協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目（GXXT-2019-033）、江蘇現(xiàn)代作物協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（JCIC-MCP）

陳璨，E-mail：chencan-L@163.com。韓南南，E-mail：1565635050@qq.com。陳璨和韓南南為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者司紅起，E-mail：sihq2002@163.com。通信作者馬傳喜，E-mail：machuanxi@ahau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）