林定文 崔哲哲

(廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與學(xué)校衛(wèi)生所，南寧市 530028，電子郵箱：drldw@163.com)

【提要】 中國政府在《遏制結(jié)核病行動計(jì)劃(2019-2022年)》中提出，各地要提高結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷能力，縮短診斷時(shí)間，病原學(xué)陽性的肺結(jié)核患者耐藥篩查率應(yīng)達(dá)90%以上，最大限度發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核病患者。但目前傳統(tǒng)的檢測方法不但耗時(shí)長，而且精確度有限。微生物全基因組測序技術(shù)是近年來興起的結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定、耐藥檢測和公共衛(wèi)生監(jiān)測手段。本文對近年來全基因組測序在結(jié)核病病原學(xué)診斷和監(jiān)測領(lǐng)域中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以評估其在國內(nèi)的應(yīng)用價(jià)值和前景。

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性傳染病[1]。目前，結(jié)核病疫情形勢依然嚴(yán)峻，2018年全球約有1 000萬例新發(fā)結(jié)核病，結(jié)核病死亡人數(shù)約150萬(其中包括25.1萬HIV陽性患者)[2]。我國是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病疫情呈高患病率、高耐藥率、高死亡率、高感染率等特點(diǎn)[3]。為此，中國政府在《遏制結(jié)核病行動計(jì)劃(2019-2022年)》[4](下稱《行動計(jì)劃》)中明確了履行“終止結(jié)核”國際承諾的行動目標(biāo)?！缎袆佑?jì)劃》提出，各地要提高結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷能力，縮短診斷時(shí)間；病原學(xué)陽性的肺結(jié)核患者耐藥篩查率應(yīng)達(dá)90%以上，最大限度發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核病患者。為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，中國政府要求相關(guān)部門開展集診斷、治療和預(yù)防于一體的綜合干預(yù)措施，并總結(jié)出可復(fù)制可推廣的防控新模式和新策略的行動綱領(lǐng)。同時(shí)，應(yīng)加快結(jié)核病診療管理的信息化建設(shè)，逐步提高醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疾控機(jī)構(gòu)和基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)患者診療服務(wù)的精準(zhǔn)性、時(shí)效性以及各機(jī)構(gòu)之間信息的互聯(lián)互通[4]?，F(xiàn)就目前全基因測序(whole-genome sequencing，WGS)技術(shù)在結(jié)核病病原學(xué)診斷和監(jiān)測中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 分枝桿菌的復(fù)合群分類

分枝桿菌種類繁多，按菌群可分為MTB復(fù)合群、麻風(fēng)分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculosismycobacteria，NTM)[5]。MTB簡稱為結(jié)核桿菌，早在1882年，德國細(xì)菌學(xué)家柯赫就已證實(shí)MTB是導(dǎo)致結(jié)核病的病原菌[1]。NTM是分枝桿菌屬內(nèi)除MTB復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌[6]。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)約160種NTM，大部分營腐生或營寄生，少部分對人體致病。NTM可侵犯肺臟、淋巴結(jié)、骨骼、皮膚和關(guān)節(jié)等組織器官[7]。近年來，NTM感染的發(fā)病率呈快速升高趨勢[8]。在我國浙江、福建、廣東等沿海省份的部分地區(qū)，因NTM導(dǎo)致的結(jié)核病患者占全部結(jié)核病患者的10%～25%[9]。由于分枝桿菌各菌種的生物學(xué)特性、致病性、耐藥性等特點(diǎn)不盡相同，對菌種進(jìn)行鑒定對于分枝桿菌及其所致疾病的基礎(chǔ)研究、預(yù)防和治療具有十分重要的意義。

2 傳統(tǒng)菌種鑒定和監(jiān)測技術(shù)瓶頸

準(zhǔn)確及時(shí)地鑒定分枝桿菌、獲取藥敏信息，對有效地控制傳染源、預(yù)防結(jié)核病至關(guān)重要[2]。通常MTB及其耐藥性檢測依賴于生物安全三級實(shí)驗(yàn)室中液體或固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)。傳統(tǒng)的L-J固體培養(yǎng)方法簡單、經(jīng)濟(jì)，易于推廣，但是培養(yǎng)周期長(8～12周)[10-11]。BACTEC MGIT 960是美國BD公司在不斷完善BACTEC MGIT 460TB技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的新一代液體培養(yǎng)熒光檢測系統(tǒng)[12]，其陽性檢出率和培養(yǎng)時(shí)間均較涂片和L-J培養(yǎng)基具有明顯的優(yōu)勢，可縮短報(bào)告時(shí)間，應(yīng)用價(jià)值獲得全球廣泛認(rèn)可[13]。目前，國內(nèi)的結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室大多采用對硝基苯甲酸和噻吩二羧酸肼培養(yǎng)基生長試驗(yàn)，對分枝桿菌培養(yǎng)陽性的菌株進(jìn)行鑒定。其中，在硝基苯甲酸和噻吩二羧酸肼兩種培養(yǎng)基上均生長的細(xì)菌為疑似NTM；只在其中一種培養(yǎng)基上生長或者在兩種培養(yǎng)基上均不生長的細(xì)菌則認(rèn)為是MTB復(fù)合群[5]。對于疑似NTM，可以使用16S rRNA基因擴(kuò)增測序后全局比對標(biāo)準(zhǔn)DNA序列的方式進(jìn)行菌種判定，一般認(rèn)為序列一致性達(dá)到97%以上為同種細(xì)菌[14]。根據(jù)序列比對的結(jié)果，培養(yǎng)基長生試驗(yàn)篩選得到的疑似NTM仍有一小部分可能是MTB，也可能是諾卡氏菌。由于分子診斷得到的結(jié)果比培養(yǎng)基長生試驗(yàn)更可靠，目前已有部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用基因芯片或分子探針進(jìn)行NTM的診斷，其檢測的分子靶標(biāo)覆蓋16S rRNA、hsp65等基因，但目前的研究結(jié)果提示單個(gè)基因(如16S rRNA基因)的分辨率只能鑒定到同屬，而無法完全鑒定到同種[15]。而無論是菌種鑒定還是藥敏試驗(yàn)，這些傳統(tǒng)技術(shù)均具有簡單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢，但耗時(shí)較久，操作復(fù)雜且結(jié)果不穩(wěn)定，可重復(fù)性差，遠(yuǎn)不能滿足快速準(zhǔn)確檢測的需要[16]。

在病原監(jiān)測方面，結(jié)核病是我國法定報(bào)告的乙類傳染病。由于目前所使用的技術(shù)手段和報(bào)告方式具有局限性，肺結(jié)核聚集性疫情的發(fā)現(xiàn)大多依賴于回顧性的流行病學(xué)研究。對于疾控部門而言，疫情暴發(fā)的早期識別和預(yù)警，乃至早期的干預(yù)控制，依然是結(jié)核病防控的難題。這種困難體現(xiàn)為：由于分辨率低，病原分型信息無法支持決策，同時(shí)也無法在建立診斷的第一時(shí)間獲得；現(xiàn)場流行病學(xué)信息往往缺失或者失真，而公共衛(wèi)生事件的預(yù)警不足和處置不當(dāng)會導(dǎo)致其演變?yōu)楣残l(wèi)生危機(jī)事件，影響社會穩(wěn)定。在臨床診斷方面，正如《行動計(jì)劃》提出的2022年定點(diǎn)醫(yī)院能力建設(shè)目標(biāo)，目前我國的基層(市級和以下)定點(diǎn)醫(yī)院依然缺乏必要的病原學(xué)診斷能力，上述現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)經(jīng)多年的推廣后仍不具有足夠的可及性。按目前制度要求和人員、設(shè)備的現(xiàn)狀，縣級結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院開展痰涂片、痰培養(yǎng)時(shí)，陽性標(biāo)本或培養(yǎng)物需送市級相關(guān)機(jī)構(gòu)開展菌種鑒定和藥敏培養(yǎng)，這導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告所需時(shí)間長，患者常得不到及時(shí)、精準(zhǔn)的治療，同時(shí)較長的結(jié)果等待期也使患者的耐心耗盡，甚至失訪。此外，在標(biāo)本上送運(yùn)輸?shù)倪^程中，標(biāo)本的活性和生物安全存往往也得不到保障。因此，目前傳統(tǒng)菌種的鑒定和監(jiān)測依然困難重重，尚不能利用現(xiàn)有傳統(tǒng)技術(shù)手段及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷和防治結(jié)核病。

3 WGS技術(shù)在結(jié)核病病原學(xué)診斷和監(jiān)測中的應(yīng)用

隨著微生物基因組流行病學(xué)的興起和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，上述傳統(tǒng)手段無法解決的問題有望得到解決。WGS技術(shù)的優(yōu)勢在其是目前分辨率最高的分子分型和鑒定技術(shù)，并且可以一次性考察所有關(guān)注的病原信息點(diǎn)，包括病原的物種、亞型以及毒力基因、抗生素抗性等特性，且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)容易標(biāo)準(zhǔn)化以進(jìn)行室間評價(jià)、歷史數(shù)據(jù)比較等。

微生物基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核病病原學(xué)的診斷和監(jiān)控，一方面能滿足結(jié)核病全面、快速、可靠的病原學(xué)診斷的需要；另一方面其高分辨率的優(yōu)勢能滿足結(jié)核病流行病學(xué)的調(diào)查與控制[17-18]。將結(jié)核病的診斷與控制工作合二為一(診防一體)，充分利用有限的資源，有利于實(shí)現(xiàn)控制結(jié)核病疫情的目標(biāo)。隨著WGS技術(shù)的成熟，一些公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，如美國疾病預(yù)防控制中心和食品藥品監(jiān)督管理局，已經(jīng)在嘗試使用全基因組序列比對——DNA-DNA雜交的數(shù)字化模擬手段作為細(xì)菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。2013年，K?ser等[19]使用WGS技術(shù)成功將結(jié)核桿菌的檢驗(yàn)時(shí)間從幾周縮短到幾天，這表明WGS應(yīng)用于結(jié)核病病原菌的診斷具有很高的可行性。2015年7月，Brown等[20]首次在未培養(yǎng)的痰液樣本中成功進(jìn)行MTB基因組測序，但由于操作復(fù)雜并且成本較高，目前難以滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。

我國專家在最近發(fā)表的專家共識中，明確了結(jié)核病聚集性疫情調(diào)查時(shí)WGS技術(shù)在病原學(xué)分子分型中的應(yīng)用價(jià)值[21]。同時(shí)，隨著測序價(jià)格的持續(xù)降低，WGS技術(shù)的費(fèi)用已經(jīng)可以被發(fā)展中國家的一線檢驗(yàn)或流行病監(jiān)控工作所接受。但也有專家認(rèn)為，在WGS技術(shù)廣泛應(yīng)用之前，仍需要大量的標(biāo)準(zhǔn)化和驗(yàn)證性的工作，尤其是在高負(fù)擔(dān)的發(fā)展中國家[22]。

4 WGS技術(shù)在耐藥檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用

美國疾病預(yù)防與控制中心指出，快速靈敏的MTB培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)是控制結(jié)核病的首要條件[18]。利福平是治療結(jié)核病最有效的藥物之一，然而根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，2018年新發(fā)結(jié)核病患者中約有48.4萬例利福平耐藥患者，其中78%為多重耐藥結(jié)核病，耐藥結(jié)核病已成為全球結(jié)核病治療和預(yù)防所面臨的最大威脅之一[2]。MTB的耐藥問題已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題[23-25]，也是我國結(jié)核病防治工作中面臨的挑戰(zhàn)之一，廣泛耐藥結(jié)核病的成功診斷和治療取決于是否獲得全面、準(zhǔn)確的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果。但藥敏檢測結(jié)果需要數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間才獲得，并且許多地區(qū)缺乏所需的實(shí)驗(yàn)室條件和資源，即使在資源充足的國家，傳統(tǒng)的方法完成所有檢測通常也需要1～2個(gè)月，藥敏周期長也可能導(dǎo)致藥敏結(jié)果出現(xiàn)偏差[26-27]。此外，培養(yǎng)法藥敏表型檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性通常較差，特別是對于吡嗪酰胺等藥物[28]。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室亟須引入快速的分枝桿菌藥敏試驗(yàn)方法。

隨著MTB耐藥分子機(jī)制逐漸被闡明，通過檢測耐藥基因突變來快速診斷耐藥結(jié)核病日益受到重視[29-31]，分子檢測的使用頻次不斷增加。我國于2017年將分子診斷技術(shù)納入了肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，大幅提高了結(jié)核病病原識別和耐藥監(jiān)測的效率[32]，目前已經(jīng)有商品化的Gepheid Gene Xpert MTB/利福平以及Hain GenoType MTBDRplusand MTBDRsl被證明可以縮短結(jié)核病患者診斷并開始治療的時(shí)間[33]。雖然這些技術(shù)可以使越來越多的耐藥結(jié)核病患者被盡早發(fā)現(xiàn)和治療，但仍存在重要的診斷缺口。2018年經(jīng)細(xì)菌學(xué)確診的結(jié)核病患者接受利福平耐藥性檢測的比例為51%，而2018年接受治療的耐多藥及僅利福平耐藥患者(156 071例)僅占罹患耐多藥及僅利福平耐藥(約50萬)患者的1/3[3]。已有的分子檢測技術(shù)能快速鑒定耐藥菌株或進(jìn)行部分藥敏檢測，但只能檢測微一小部分的生物基因組，不能滿足全部的檢測需求[26-27,33]。因此，迫切需要能提供結(jié)核病菌株全面耐藥信息的快速診斷技術(shù)，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

其他分子檢測技術(shù)通過探針或特定基因序列雜交的方法可以間接鑒定MTB或檢測有限的耐藥突變信息，而WGS技術(shù)可以檢測全部基因序列信息，包括其他分子檢測技術(shù)可能無法識別的插入、缺失或者罕見突變等序列層面的信息，例如異質(zhì)性耐藥或者混合感染[34]，并且可多次檢測每個(gè)DNA堿基。因此WGS技術(shù)為耐藥結(jié)核病的檢測提供了一個(gè)強(qiáng)有力的選擇，其可以提供更準(zhǔn)確的深度基因多態(tài)性檢測，目前已經(jīng)有多種WGS平臺可以用于耐藥結(jié)核病的診斷。

耐藥結(jié)核病的流行病學(xué)監(jiān)控、公共衛(wèi)生干預(yù)和控制依賴于全面、快速、準(zhǔn)確的檢測，包括MTB復(fù)合物鑒定、藥敏檢測和細(xì)菌基因分型。WGS技術(shù)能提供更全面的結(jié)果，在一次試驗(yàn)中完成菌種鑒定、藥敏檢測和基因分型，但受限于結(jié)核桿菌樣本的核酸總量，需要對原始樣本進(jìn)行一定的培養(yǎng)[27,35-36]。Coll等[37]的研究顯示，與使用商品化的分子探針法相比，使用WGS技術(shù)對結(jié)核病的病原體進(jìn)行耐藥檢測具有相似或更高的敏感度，這表示W(wǎng)GS技術(shù)有取代目前廣泛應(yīng)用的分子探針法的可能。同時(shí)，Coll等[38]也成功將高分辨率的WGS技術(shù)應(yīng)用于MTB的分子分型上。2018年，德國結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室評估了Cepheid GeneXpert MTB/利福平、線性探針檢測(Hain GenoType MTBDRplus2.0 and MTBDRsl2.0)及WGS 3種分子藥敏檢測技術(shù)對多耐藥、廣泛耐藥結(jié)核病治療效果的影響，結(jié)果顯示，WGS技術(shù)可用于判斷復(fù)雜的耐藥，與基于藥敏表型檢測結(jié)果建立的治療方案相比，WGS技術(shù)的處方一致性最高，有利于為患者提供更合適的治療方案[39]。

一項(xiàng)橫跨6大洲16個(gè)國家、10 209個(gè)菌株的研究顯示[40]：利用WGS技術(shù)能夠準(zhǔn)確判斷抗結(jié)核藥物的敏感性，WGS技術(shù)的敏感性、特異性可以滿足臨床應(yīng)用需要；同時(shí)，WGS技術(shù)能像藥敏表型檢測法一樣提示不應(yīng)使用哪種藥物而應(yīng)該使用哪種藥物治療。在日常使用WGS技術(shù)進(jìn)行結(jié)核菌診斷時(shí)，還能降低培養(yǎng)法和表型分析等的工作量[40]。英國、荷蘭以及美國的公共衛(wèi)生當(dāng)局已經(jīng)決定，當(dāng)WGS檢測顯示受試菌株對一線抗結(jié)核藥物敏感時(shí)，將不再使用藥敏表型檢測法進(jìn)行分析，這一系統(tǒng)性的改變節(jié)省了大量的費(fèi)用和時(shí)間[40]。為指導(dǎo)新的基因組學(xué)技術(shù)的實(shí)施應(yīng)用，世界衛(wèi)生組織在2018年發(fā)布了WGS技術(shù)用于MTB耐藥檢測的技術(shù)指南，該指南總結(jié)了WGS技術(shù)的特點(diǎn)以及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，以指導(dǎo)中等收入和低收入國家建設(shè)WGS平臺體系，從而用于診斷結(jié)核病的耐藥性[40]。WGS技術(shù)以其顯著的優(yōu)勢，逐漸改變結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的診斷流程。隨著WGS技術(shù)在臨床中的廣泛應(yīng)用，藥敏表型檢測的應(yīng)用將會減少，尤其是藥敏表型法檢測結(jié)果不可靠的藥物，例如吡嗪酰胺。另外，在沒有藥敏表型法檢測能力的地區(qū)，同樣可以使用WGS進(jìn)行全面、快速、低成本的檢測[41]。

5 小 結(jié)

綜上所述，盡管基因組學(xué)診斷技術(shù)在結(jié)核病致病菌菌種鑒定、耐藥檢測和公共衛(wèi)生監(jiān)測中已經(jīng)展現(xiàn)了一定的潛力，但其存在運(yùn)行成本高、操作復(fù)雜等問題，目前只在幾個(gè)發(fā)達(dá)國家少量應(yīng)用，其在我國臨床和疾控工作中的運(yùn)行模式仍需要探索和優(yōu)化，其對臨床和公共衛(wèi)生的實(shí)際效能仍需要評估和驗(yàn)證。