GSTP1和RasGRP1在乳腺癌中的表達(dá)及對MCF-7細(xì)胞增殖遷移能力的影響

戴素華，朱正秋

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州221002；2. 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 徐州221002）

乳腺癌是全球女性發(fā)病率位于第1 位、死亡率位于第2 位的惡性腫瘤[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增乳腺癌病例115 萬，占全部女性腫瘤的23%；死亡病例41 萬，占全部女性腫瘤的14%[2]。目前乳腺癌的早期篩查診斷和預(yù)后判斷已取得了顯著成績[3-4]，但仍有7%的乳腺癌患者在診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為10%～30%[5-6]。因此，發(fā)現(xiàn)并深入研究更多、有效的乳腺癌的早期診斷及靶向調(diào)控的分子靶標(biāo)是改善患者生存質(zhì)量及提高生存率的關(guān)鍵。谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S transferase P1, GSTP1）與Ras 信號蛋白在大量的惡性腫瘤，如大腸癌及非小細(xì)胞癌中異常表達(dá)，且是藥物抗癌的重要靶點(diǎn)[7-8]，文獻(xiàn)顯示[9]， GSTP1 和Ras 鳥苷酸釋放蛋白1（Ras guanylnueleotide releasing proteins 1, RasGRP1）與三陰性乳腺癌患者的總體生存率及無瘤生存率有關(guān)，RasGRP1 是重要的Ras 信號蛋白之一，GSTP1 與RasGRP1 有可能作為潛在的三陰性乳腺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。本研究擬探討GSTP1 和RasGRP1 在乳腺癌的表達(dá)及細(xì)胞功能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2019年6月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治并接受手術(shù)治療且病理確診為乳腺癌的80 例初診患者，術(shù)中取患者的乳腺癌組織和對應(yīng)的癌旁組織?；颊呔鶠榕裕挲g39～68 歲，中位年齡52 歲；腫瘤直徑≤2 cm 16 例，>2～5 cm 38 例，>5 cm 26 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27 例；TNM 分 期：Ⅰ期41 例，Ⅱ期24 例，Ⅲ期15 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)術(shù)后病理診斷；術(shù)前未接受過放化療及內(nèi)分泌治療；所有患者均有完整的臨床病理資料；患者和/或家屬了解手術(shù)及治療的全過程及風(fēng)險，均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：除乳腺癌，患者還存在其他惡性腫瘤疾病；合并嚴(yán)重的肝、腎、心和腦功能障礙者；哺乳期或妊娠女性。

1.2 細(xì)胞、試劑和儀器

雌激素受體陽性人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）。GSTP1 和RasGRP1 抗體（鼠來源，南京碧云天生物科技有限公司），兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠二抗（美國Abcam 公司），免疫組織化學(xué)試劑（南京泰康生物科技有限公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT）、Annexin V-FITC/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡試劑盒、青霉素-鏈霉素混合溶液（美國Sigma 公司）。微量紫外可見光分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠電泳儀、垂直電泳槽及凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），OLIPICS 電子顯微鏡（上海精密儀器有限公司）。

1.3 GSTP1轉(zhuǎn)染及分組

按Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書將空質(zhì)粒（陰性對照）、GSTP1-siRNA 轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，利用G418 抗性篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，分別為陰性對照1組和GSTP1-siRNA 組，將同期正常生長的MCF-7 細(xì)胞作為對照1 組。

1.4 RasGRP1轉(zhuǎn)染及分組

按Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書將空質(zhì)粒（陰性對照）、RasGRP1-siRNA 轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，利用G418 抗性篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，分為陰性對照2 組和RasGRP1-siRNA 組，將同期正常生長的MCF-7細(xì)胞作為對照2 組。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 免疫組織化學(xué)檢測GSTP1 和RasGRP1 陽性表達(dá)將乳腺癌組織和癌旁組織石蠟標(biāo)本切片，厚度為3 mm/片，3% H2O2室溫孵育5 min，采用去離子水沖洗，10%牛奶蛋白封閉，室溫孵育5 min，加入GSTP1 和RasGRP1 抗體，37℃孵育1.5 h，滴加HRP 標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，PBS 沖洗，加入NBT/BCIP 顯色、復(fù)染、脫水、封片，電子顯微鏡下觀察并拍照。GSTP1 和RasGRP1 陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：均在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá)，呈黃色至棕黃色顆粒。

1.5.2 計(jì)算MCF-7細(xì)胞抑制率調(diào)整MCF-7 細(xì)胞密度為4×103個/ml，對照1 組、陰性對照1 組和GSTP1-siRNA 組分別取200 μl 于96 孔板，加20 μl 5 mg/ml 的四氮唑藍(lán)鹽（MTT）繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h和48 h，加200 μl 二甲基亞砜充分溶解，在酶標(biāo)儀570 nm 波長處檢測光密度（OD）值。MCF-7 細(xì)胞的抑制率=[（對照1 組OD 值-陰性對照1 組OD 值/GSTP1-siRNA 組OD 值）]/對照1 組OD 值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次，取平均值。按上述操作再進(jìn)行對照2 組、陰性對照2 組和RasGRP1-siRNA 組的MCF-7細(xì)胞抑制率的計(jì)算。

1.5.3 Transwell 法檢測細(xì)胞遷移調(diào)整MCF-7 細(xì)胞密度為8×103個/ml，各組取1.0 ml 于6 孔板，取MCF-7 細(xì)胞消化液置于Transwell 小室上室，下室加入改良DMEM 培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清），培養(yǎng)并收集透膜細(xì)胞，甲醛固定，HE 染色，計(jì)數(shù)透膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.5.4 Western blotting 檢測GSTP1和RasGRP1蛋白相對表達(dá)量提取蛋白，100℃溫浴10 min，SDSPAGE凝膠電泳，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)膜至PVDF，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，分別經(jīng)小鼠抗人GSTP1和RasGRP1 抗體系統(tǒng)處理后，采用蛋白熒光檢測法判定蛋白相對表達(dá)量，Image J軟件分析灰度值，β-actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織和癌旁組織中GSTP1和RasGRP1的陽性表達(dá)情況

乳腺癌組織和癌旁組織中GSTP1 陽性分別為64例和34 例，RasGRP1 陽性分別16 例和53 例；與癌旁組織比較，乳腺癌組織的GSTP1 陽性表達(dá)升高（P<0.05），RasGRP1 陽性表達(dá)降低（P<0.05）。見表1和圖1。

表1 乳腺癌組織與癌旁組織的GSTP1和RasGRP1陽性表達(dá)比較 [n=80，例（%）]

圖1 乳腺癌組織與癌旁組織的GSTP1和RasGRP1陽性表達(dá) （免疫組織化學(xué)×100）

2.2 不同臨床病理特征乳腺癌患者的GSTP1 和RasGRP1陽性率比較

不同年齡、不同腫瘤直徑的乳腺癌患者GSTP1和RasGRP1 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者GSTP1 和RasGRP1 陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者GSTP1 陽性率升高，RasGRP1 陽性率降低；不同TNM 分期的乳腺癌患者GSTP1 和RasGRP1 陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），TNM 分期越高，GSTP1 陽性率越高，RasGRP1 陽性率越低。見表2。

表2 不同臨床病理特征乳腺癌患者GSTP1和RasGRP1陽性率的比較 例（%）

2.3 各組MCF-7細(xì)胞抑制率的比較

對照1組、陰性對照1組和GSTP1-siRNA組12 h、24 h 和48 h 的MCF-7 細(xì)胞抑制率比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點(diǎn)的MCF-7細(xì)胞抑制率無差異（F=0.628，P=0.540）；②3 組的MCF-7 細(xì)胞抑制率有差異（F=88.301，P=0.000），GSTP1-siRNA 組較對照1 組和陰性對照1 組高；③3 組MCF-7 細(xì)胞抑制率的變化趨勢無差異（F=0.621，P=0.651）（見表3）。對照2 組、陰性對照2組和RasGRP1-siRNA 組12 h、24 h 和48 h 的MCF-7細(xì)胞抑制率比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點(diǎn)的MCF-7 細(xì)胞抑制率有差異（F=5.088，P=0.013）；②3 組的MCF-7 細(xì)胞抑制率有差異（F=87.073，P=0.000），RasGRP1-siRNA 組較對照2 組和陰性對照2 組低；③3 組MCF-7 細(xì)胞抑制率的變化趨勢有差異（F=4.999，P=0.003）。見表4。

表3 對照1組、陰性對照1組、GSTP1-siRNA組不同時間的MCF-7細(xì)胞抑制率比較 （±s）

表3 對照1組、陰性對照1組、GSTP1-siRNA組不同時間的MCF-7細(xì)胞抑制率比較 （±s）

組別12 h 24 h 48 h對照1組陰性對照1組GSTP1-siRNA組0.0±0.0 0.1±0.1 12.6±4.6 0.0±0.0 0.1±0.1 10.6±5.4 0.0±0.0 0.1±0.2 9.8±3.4

表4 對照2組、陰性對照2組、RasGRP1-siRNA組不同時間的MCF-7細(xì)胞抑制率比較 （±s）

表4 對照2組、陰性對照2組、RasGRP1-siRNA組不同時間的MCF-7細(xì)胞抑制率比較 （±s）

組別12 h 24 h 48 h對照2組陰性對照2組RasGRP1-siRNA組0.0±0.0 0.1±0.2-3.6±1.2 0.0±0.0 0.1±0.1-2.9±1.2 0.0±0.0 0.1±0.1-1.6±0.9

2.4 各組MCF-7細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)比較

對照1 組、陰性對照1 組、GSTP1-siRNA 組的MCF-7 細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，對照1 組與陰性對照1 組MCF-7 細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），GSTP1-siRNA組MCF-7細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)較對照1組、陰性對照1組減少（P<0.05）（見表5）。對照2組、陰性對照2組、RasGRP1-siRNA組的MCF-7細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，對照2 組與陰性對照2 組MCF-7細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），RasGRP1-siRNA 組MCF-7 細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)較對照2組、陰性對照2組增加（P<0.05）。見表6。

表5 對照1組、陰性對照1組、GSTP1-siRNA組的MCF-7細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表5 對照1組、陰性對照1組、GSTP1-siRNA組的MCF-7細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

注：?與對照1組和陰性對照1組比較，P<0.05。

組別透膜細(xì)胞數(shù)/個對照1組陰性對照1組GSTP1-siRNA組F 值P 值75.9±12.4 73.6±11.6 34.5±10.0?25.093 0.000

表6 對照2組、陰性對照2組、RasGRP1-siRNA組的MCF-7細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表6 對照2組、陰性對照2組、RasGRP1-siRNA組的MCF-7細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

注：?與對照2組和陰性對照2組比較，P<0.05。

組別透膜細(xì)胞數(shù)/個對照2組陰性對照2組RasGRP1-siRNA組F 值P 值76.3±10.6 74.6±11.7 103.6±23.6?5.914 0.013

2.5 各組細(xì)胞GSTP1和RasGRP1蛋白表達(dá)

對照1 組、陰性對照1 組、GSTP1-siRNA 組GSTP1 蛋白相對表達(dá)量為（0.7±0.2）、（0.6±0.2）和（0.2±0.1），3 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.000，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，對照1 組與陰性對照1 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），GSTP1-siRNA組GSTP1蛋白相對表達(dá)量較對照1組和陰性對照1 組降低（P<0.05）。對照2組、陰性對照2組和RasGRP1-siRNA 組RasGRP1 蛋白相對表達(dá)量分別為（1.5±0.5）、（1.6±0.6）和（0.4±0.1），3 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.871，P=0.001）；進(jìn)一步兩兩比較，對照2 組與陰性對照2 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），RasGRP1-siRNA 組RasGRP1 蛋白相對表達(dá)量較對照2 組和陰性對照2 組降低（P<0.05）。見圖2、3。

圖2 各組GSTP1蛋白表達(dá)

圖3 各組RasGRP1蛋白表達(dá)

3 討論

作為GSTπ 亞家族成員之一，第GSTP15 外顯子第81 位點(diǎn)的A→G 堿基被替代，GSTP1 酶的第105 位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸，GSTP1 酶活性與底物特異性發(fā)生改變，穩(wěn)定性與催化活性也顯著降低。報道顯示，GSTP1rs1695 基因多態(tài)性與前列腺癌、結(jié)直腸癌、食管癌、肺癌、膀胱癌及胃癌等多種惡性腫瘤的易感性有關(guān)[10-12]，可能與GSTP1 參與致癌物的代謝有關(guān)。GSTP1 通過參與細(xì)胞的新陳代謝、解毒及清除損害基因的外源性化合物，抑制或緩解DNA 損傷和癌變。誘導(dǎo)大多數(shù)耐藥的腫瘤細(xì)胞GSTP1 過表達(dá)或?qū)胪庠葱訥STP1基因后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物水平顯著降低，而降低GSTP1 表達(dá)或采用反義寡核苷酸技術(shù)阻斷GSTP1 后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物水平又顯著增加，同時能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[13]。GSTP1 可能是耐藥標(biāo)志物之一，檢測腫瘤組織的GSTP1 表達(dá)可用于預(yù)測化療的耐藥性[13-15]。GSTP1 蛋白氨基末端的變異與乳腺癌的易感性有關(guān)，研究也顯示GSTP1 與三陰性乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80 例乳腺癌組織、癌旁組織的GSTP1 陽性分別為64 例（80.00%）和34 例（42.50%），與癌旁組織比較，乳腺癌組織的GSTP1陽性表達(dá)率升高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者GSTP1 陽性表達(dá)率升高，且TNM 分期越高，GSTP1 陽性表達(dá)率越高；GSTP1-siRNA 組MCF-7 細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)較對照1 組、陰性對照1 組減少。本研究結(jié)果證實(shí)GSTP1 可為研究乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供重要線索，為乳腺癌治療提供靶點(diǎn)。

RasGRP1 主要表達(dá)在T 細(xì)胞中，在B 細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肥大細(xì)胞和一些腎臟組織中呈低表達(dá)。除了在免疫細(xì)胞中表達(dá)，RasGRP1 在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中也有表達(dá)，其作用是在佛波醇酯的刺激下介導(dǎo)Ras 的活化，過度表達(dá)RasGRP1 能通過Ras 活化使表皮在再生時對腫瘤刺激物更敏感。RasGRP1 在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的分化與內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用，研究表明RasGRP1 在正常結(jié)直腸組織的表達(dá)高于結(jié)直腸腺癌組織，且高表達(dá)的RasGRP1 與結(jié)直腸腺癌更好的預(yù)后有關(guān)[16-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，乳腺癌組織的RasGRP1 陽性表達(dá)率降低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的RasGRP1 陽性表達(dá)率降低，且TNM 分期越高，RasGRP1 陽性表達(dá)率越低；RasGRP1-siRNA組MCF-7細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)較對照2組、陰性對照2組增加。由此可見RasGRP1 表達(dá)對乳腺癌是保護(hù)因素。

報道顯示[7]，大腸癌患者癌組織的GSTP1 與Ras相關(guān)蛋白表達(dá)異常，給予黃芪聯(lián)用莪術(shù)治療后發(fā)現(xiàn)，黃芪聯(lián)用莪術(shù)可調(diào)節(jié)GSTP1 與Ras 相關(guān)蛋白而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤新生血管生成及增強(qiáng)機(jī)體免疫的效果，由此可見GSTP1 和RasGRP1 之間存在某種緊密的關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，乳腺癌組織GSTP1 和RasGRP1 均呈異常表達(dá)。文獻(xiàn)報道[18]GSTP 1 表達(dá)升高可影響下游基因轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)GSTP1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)乳腺癌對他莫昔芬和氟維司群的耐藥性，增加乳腺癌對表阿霉素和紫杉醇的敏感性。WANG 等[16]使用Cox 回歸對乳腺癌內(nèi)在亞型調(diào)整模型的總生存期和無病生存期量化危害比的研究顯示，RasGRP1 高表達(dá)與更好的總生存期相關(guān)[H^R 0.89，95%CI：（0.82，0.97）]，RasGRP1 與更好的無病生存期相關(guān)[H^R 0.87，95%CI：（0.81，0.95）]，GSPT1表達(dá)與較短的無病生存期相關(guān)[H^R 1.33，95%CI：（1.14，1.55）]，提示GSPT1 與RasGRP1 可以作為乳腺癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和/或治療靶標(biāo)。RasGRP1低表達(dá)及GSTP1 高表達(dá)可直接影響淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤對藥物的敏感性和耐受性[19]，可見GSTP1 和RasGRP1 之間關(guān)系密切，但兩者之間的關(guān)聯(lián)仍需深入探討。

綜上所述，GSTP1 和RasGRP1 在乳腺癌均呈異常表達(dá)，可影響MCF-7 細(xì)胞增殖遷移能力。