張 帥,馮子岑，張云山

(天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，天津 300100)

近十年來，世界范圍內(nèi)不孕癥發(fā)病率已由10%增加到15%[1]，其中由于各種原因?qū)е碌穆殉苍缢?premature ovarian failure,POF)女性患者占不孕人群總數(shù)的1%～3%[2]。目前大多POF患者由于缺乏健康配子而無法生育自身遺傳學(xué)后代，僅有極少數(shù)患者依靠供卵及輔助生殖才能完成生育，而這又涉及倫理、社會傳統(tǒng)觀念等因素影響，因此限制了其在臨床上的應(yīng)用。最近越來越多研究顯示[3-5]，在特定培養(yǎng)條件下可將小鼠多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells,PSCs)誘導(dǎo)分化為卵母細(xì)胞，并具有正常受精、卵裂能力，目前已經(jīng)成功獲得健康子代小鼠出生。無疑，這一研究成果將會為渴望生育自己遺傳后代POF女性帶來巨大希望。本文就近年來國外關(guān)于小鼠和人類干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞(female germ cells,FGCs)分化的研究進(jìn)展綜述如下。

1 干細(xì)胞定義及來源分類

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)其分化潛能不同[6]，干細(xì)胞可分為全能干細(xì)胞(totipotent stem cells)、多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells,PSCs)、專能干細(xì)胞(multipotent stem cells)和單能干細(xì)胞(unipotent stem cells)。

1.1 全能干細(xì)胞 是指受精卵到桑椹胚時期的細(xì)胞，可分化成任何種類的細(xì)胞，并能發(fā)育成完整個體。

1.2 多能干細(xì)胞 是指可以分化為任何一種組織類型、但不能分化為生物個體的細(xì)胞，主要包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。

1.3 專能干細(xì)胞 是指有能力在一個特定的譜系內(nèi)分化成所有類型的細(xì)胞，在機(jī)體發(fā)育、組織修復(fù)和保護(hù)過程中起著重要作用，如成體干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞等。專能干細(xì)胞具有許多優(yōu)點和用途，目前主要被用于治療不同的疾病，如脊髓損傷、骨折、自身免疫性疾病等[6]。

1.4 單能干細(xì)胞 主要是指組織特異性前體細(xì)胞，在體內(nèi)通常只能形成一種細(xì)胞類型，如造血干細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)、卵巢干細(xì)胞(ovarian stem cells,OSCs)等。雖然目前關(guān)于卵巢上皮中是否存在OSCs仍存爭議，但最近越來越多的報道，包括小鼠、綿羊、兔、狨猴及人類等研究結(jié)果均表明卵巢上皮中確實存在極少量的OSCs[7]。

2 生殖細(xì)胞的體內(nèi)發(fā)生

哺乳動物生殖細(xì)胞，包括精子和卵子均來自于共同的配子前體細(xì)胞-PGCs。

小鼠PGCs最早發(fā)現(xiàn)于胚胎發(fā)育的第6.25日(E6.25)，位于胚胎外胚層遠(yuǎn)端，隨后進(jìn)行分化、遷移并于E10.5左右到達(dá)生殖嵴[8]。人類PGCs最早發(fā)現(xiàn)于妊娠第3周末，位于卵黃囊內(nèi)胚層的背側(cè)壁，第4周時開始遷移，并于5～6周時遷移至生殖嵴[5]。PGCs到達(dá)生殖嵴后，依據(jù)其周圍體細(xì)胞不同的誘導(dǎo)信號而最終分化為精子或卵母細(xì)胞?？傮w來說，哺乳動物PGCs在向原始性腺遷移過程中經(jīng)歷了廣泛的表觀遺傳重編程，包括全基因組DNA去甲基化、基因印記清除、雌性失活X染色體的重塑及重新激活等[9]。

3 各種干細(xì)胞向FGCs誘導(dǎo)分化

3.1 ESCs向FGCs誘導(dǎo)分化 ESCs是一種來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能干細(xì)胞，具有分化為體內(nèi)所有類型細(xì)胞包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的能力。有關(guān)干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究最早始于三個最初出版物的報道，即研究人員采用擬胚體(embryoid body,EB)培養(yǎng)方式[10-12]，在體外將小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)誘導(dǎo)分化成類卵原細(xì)胞或精子細(xì)胞，不僅具有與卵原細(xì)胞和精子相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還能檢測到生殖細(xì)胞相關(guān)的VASA、Sycp3、Dmc1和FE-J1等特異標(biāo)記物的表達(dá)。需指出的是，可能由于初期研究方法不夠成熟及其他條件的限制等，導(dǎo)致誘導(dǎo)分化的成功率一般很低，因此以上三個研究均未對其后續(xù)受精、胚胎發(fā)育能力做進(jìn)一步報道。

此后，研究人員不斷對誘導(dǎo)培養(yǎng)方法加以改進(jìn)、優(yōu)化，證實了mESCs通過早期體外培養(yǎng)、后期移植到體內(nèi)發(fā)育相結(jié)合的方式可獲得不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞，進(jìn)而借助體外成熟、受精及移植后可獲得健康子代小鼠出生[13]。隨著研究不斷深入，有一結(jié)論被研究人員普遍接受，即由小鼠PSCs(主要包括ESCs和iPSCs)先經(jīng)歷培養(yǎng)至外胚層樣細(xì)胞(epiblast-like cells,EpiLCs)再生成原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(primordial germ cell like cells,PGCLCs)，然后將PGCLCs與性腺體細(xì)胞結(jié)合培養(yǎng)是目前認(rèn)為誘導(dǎo)mFGCs最有效的方法[14-15]。

然而，也有研究人員對使用ESCs進(jìn)行科學(xué)研究操作持反對意見。Ciccocioppo等[16]認(rèn)為分離ESCs過程涉及到對囊胚的破壞，以及干擾胚胎發(fā)育過程是一種不道德行為。Sheikhansari等[17]也指出，一方面雖然ESCs是所有干細(xì)胞中最具有多能性、具有無限分化成各種細(xì)胞類型的能力；但另一方面，正是由于其有無限增殖的潛能，誘導(dǎo)分化過程同時可能導(dǎo)致畸胎瘤甚至癌癥發(fā)生的風(fēng)險。因此，考慮到以上倫理和安全等方面問題，ESCs在臨床上的應(yīng)用受到很大限制，特別是有學(xué)者在體外成功誘導(dǎo)出iPSCs后，研究人員也就慢慢忽視了其在干細(xì)胞研究中的使用價值，而逐漸轉(zhuǎn)向使用iPSCs作為替代來源進(jìn)行研究[18]。

3.2 iPSCs向FGCs誘導(dǎo)分化 iPSCs是通過將外源特定基因或轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已經(jīng)分化成熟的體細(xì)胞進(jìn)行重編程而形成的人工干細(xì)胞，具有與ESCs相似的發(fā)育潛能。2006年，Takahashi等[19]首次報道將Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四種因子導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞后成功誘導(dǎo)出前者來源的多能干細(xì)胞，即miPSCs。由于iPSCs來源廣泛，同時可避免因ESCs研究而帶來的倫理問題以及干細(xì)胞異體移植治療時存在的免疫排斥等問題，因此被越來越多的研究人員所重視，逐漸將其視為進(jìn)行ESCs研究的良好替代來源[20]。此后，不同研究人員對iPSCs進(jìn)行了更加深入的研究。

最近，Hikabe等[21]采用“兩步法”培養(yǎng)策略，即向培養(yǎng)液中添加基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和激活素A先將iPSCs培養(yǎng)至EpiLCs，隨后在含BMP4、SCF、LIF、EGF培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至PGCLCs。結(jié)果顯示iPSCs衍生而來的MⅡ卵母細(xì)胞具有正常受精能力，并能發(fā)育到妊娠足月?？傮w來說，目前研究人員對iPSCs向生殖細(xì)胞的分化已做了大量研究，而且大多以小鼠動物模型為研究對象。而將人類iPSCs誘導(dǎo)分化為FGCs仍具有挑戰(zhàn)性。因為在自然條件下，由干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化是一個漫長過程，包括在子宮內(nèi)(囊胚階段)和胎兒體內(nèi)發(fā)育過程及具體調(diào)控機(jī)制，目前研究人員在體外尚且難以完全模擬上述發(fā)育過程[22]。而Dyce等[23]研究具體指出，由干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的步驟中，減數(shù)分裂是一個在體外難以概括的生物學(xué)過程。因此，研究人員一般采用由iPSCs與小鼠胚胎卵巢顆粒細(xì)胞重建的“異構(gòu)卵巢”共同培養(yǎng)，且4個月后可分化成人類卵原細(xì)胞，并顯示出與體內(nèi)生殖細(xì)胞相似的分化特征。盡管如此，Yamashiro等[24]認(rèn)為，由于小鼠和人類之間存在種間差異，導(dǎo)致小鼠體細(xì)胞和hPGCs之間的信號傳遞不能完全兼容，因此無法完全支持人類卵子的發(fā)生。也就是說，異構(gòu)重組卵巢培養(yǎng)方法并不是人類配子發(fā)生的有效系統(tǒng)。因此，開發(fā)一個沒有異種組織的單倍體細(xì)胞生成系統(tǒng)可能是一個有效的解決方案，即可以通過hiPSCs誘導(dǎo)分化為hPGCLCs同時，與另一hiPSCs分化來源的人卵巢顆粒細(xì)胞(代替小鼠顆粒細(xì)胞)共同培養(yǎng)而實現(xiàn)。然而，假如這種"創(chuàng)造性"的研究方案成功實施，即人工制造卵子用于受精、妊娠以及順利分娩，也就從本質(zhì)上繞開了人類正常的"兩性生殖"過程，是否會導(dǎo)致其他生殖倫理問題還需要研究人員保持警惕。目前有關(guān)iPSCs的研究還只是作為一種干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化研究的一種輔助平臺，所以iPSCs在生殖研究領(lǐng)域能否發(fā)揮更多作用，還需科研人員進(jìn)一步的探索和實踐。

最近，Hamazaki等[25]研究發(fā)現(xiàn)，添加Figla、Sohlh1、Sohlh2、Lhx8、Nobox、Taf4b、Yy1、Tbpl2等8種轉(zhuǎn)錄因子的培養(yǎng)液可將hPSCs直接轉(zhuǎn)化為卵母細(xì)胞樣細(xì)胞(oocyte-like cells,OLCs)，無需經(jīng)歷先將其培養(yǎng)至PGCs、然后再分化為卵母細(xì)胞的過程。雖然研究中顯示OLCs具有正常受精及卵裂能力，但未能驗證其是否能獲得活產(chǎn)。因此，這一成果是否具有推廣應(yīng)用研究的可行性，還需要更多的研究論據(jù)來支持。

3.3 OSCs向FGCs誘導(dǎo)分化 自2004年Johnson等[26]首次報道雌性小鼠卵巢內(nèi)發(fā)現(xiàn)OSCs，至今十幾年來，關(guān)于小鼠和人類卵巢中是否存在OSCs以及對其分離、檢測的研究，不僅在生殖醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞生理學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了很大熱情，同時也導(dǎo)致了很多研究人員的懷疑和爭議。Johnson等[26]最初研究顯示，卵巢中存在直徑5～8μm的OSCs，并有“減數(shù)分裂”特異蛋白SCP3的表達(dá)。而Virant-Klun及其小組成員研究表明[27]，卵巢表面上皮確實有OSCs的存在，但與Johnson等報道OSCs有所不同，因為這類細(xì)胞直徑僅為2～4μm，且其與ESCs有相似的DDX-4標(biāo)記物表達(dá)。有研究得出完全相反的結(jié)論，即Wagner等[28]對人類卵巢皮質(zhì)進(jìn)行單細(xì)胞分析研究，發(fā)現(xiàn)卵巢中有不同的細(xì)胞群，但沒有OSCs存在。但越來越多的研究表明[28]，小鼠和人類卵巢中確實存在極少量OSCs。最近Bhartiya等[7]通過對不同學(xué)者的研究結(jié)果進(jìn)行匯總分析得出結(jié)論，小鼠和人類卵巢中應(yīng)該存在兩種不同類型的干細(xì)胞，即包括較大尺寸(直徑5～8μm)的OSCs(具有細(xì)胞質(zhì)OCT-4B)和較小尺寸(直徑2～4μm)、表達(dá)細(xì)胞核OCT-4A的極小胚胎樣干細(xì)胞(very small embryonic-like stem cells,VSELs)。并且Bhartiya還指出，圍繞是否存在OSCs的爭議，可能與不同研究人員分離細(xì)胞的技術(shù)程序不恰當(dāng)有關(guān)。進(jìn)一步研究認(rèn)為，VSELs可能是胚胎外胚層來源的PSCs，數(shù)量極少，繼續(xù)分化可產(chǎn)生包括OSCs在內(nèi)的組織特異性祖細(xì)胞。由于其在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)相對靜止，因此也被認(rèn)為是卵巢中最原始的干細(xì)胞；而OSCs(表達(dá)FSHR3受體)在體外培養(yǎng)時，則會經(jīng)歷快速分裂并能在其分化為卵母細(xì)胞前形成生殖細(xì)胞巢(germ cell nests)。

最近，Silvestris等[29]從19例絕經(jīng)期和13例非絕經(jīng)期女性卵巢皮質(zhì)中分離出的OSCs體外研究結(jié)果顯示，來源于卵巢表面OSCs培養(yǎng)21天時可分化為成熟OLCs。隨后使用5號以及X染色體探針通過原位熒光雜交技術(shù)對其染色體的倍性含量進(jìn)行分析，結(jié)果支持OLCs為單倍體核型，由此證明了OSCs分化為OLCs的可行性。

4 目前研究存在的問題

對于干細(xì)胞向生殖細(xì)胞的分化研究，雖然研究人員已經(jīng)積累了十幾年的經(jīng)驗，但仍然存在很多棘手問題。首先，誘導(dǎo)分化成功率一直很低是主要問題[4,30](成功率通常<5%)；其次，至今仍然缺乏一個標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的模型和誘導(dǎo)分化方案。由上可知，目前用于研究的干細(xì)胞主要包括ESCs、iPSCs、OSCs以及VSELs等，由于不同來源的干細(xì)胞具有不同的分化潛能以及生長代謝機(jī)制，因此應(yīng)選擇哪種來源的干細(xì)胞進(jìn)行研究才能獲得最佳誘導(dǎo)效率，不同研究人員之間尚未達(dá)成共識。

而Bharti等[18]認(rèn)為，相對于ESCs和iPSCs兩種來源的干細(xì)胞，OSCs和VSELs應(yīng)是最佳的誘導(dǎo)干細(xì)胞的材料來源。一方面，因為前兩者具有高度多能性，因此其誘導(dǎo)分化過程導(dǎo)致畸胎瘤、癌癥的風(fēng)險則會相對較高，所以選擇后兩種來源的干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)更為合適；而另一方面，由于OSCs和VSELs直接來源于卵巢組織，更具有向OLCs分化的自然傾向性，因此在最少的培養(yǎng)條件下就能容易地分化為OLCs，同時還能在一定程度上節(jié)約研究資源和時間。因此，從目前研究現(xiàn)狀來看，如何提高干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的成功率是亟待解決的首要問題，也是研究人員、臨床醫(yī)生以及尋求干細(xì)胞治療患者必須要面對的問題。

5 展 望

目前，世界各地的研究人員正在盡最大努力使誘導(dǎo)分化方案標(biāo)準(zhǔn)化，以期獲得更安全和更理想的分化效果。隨著醫(yī)療及科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，干細(xì)胞再生與轉(zhuǎn)化技術(shù)必將日趨成熟，同時干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為生殖細(xì)胞的成功率大大提高，進(jìn)而為卵巢早衰、癌癥放化療后嚴(yán)重?fù)p傷生育力導(dǎo)致的生殖細(xì)胞缺乏不孕夫婦患者，以及絕經(jīng)期后被內(nèi)分泌紊亂疾病所困擾的老年女性帶來更多的希望和生活信心。