劉芬婷，李 蓉

[北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心；國家婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(北京大學(xué)第三醫(yī)院)；輔助生殖教育部重點實驗室(北京大學(xué))；北京市生殖內(nèi)分泌與輔助生殖技術(shù)重點實驗室，北京 100191]

反復(fù)著床失敗(recurrent implantation failure，RIF)通常是指連續(xù)三次及以上將形態(tài)良好的胚胎移植到宮腔后，胚胎始終無法在子宮內(nèi)著床的情況。RIF的病因復(fù)雜多樣，一般認(rèn)為與胚胎本身、母體子宮內(nèi)膜容受性降低或輔助生殖技術(shù)中的治療方案等因素相關(guān)[1]。2017年，Chen等明確發(fā)現(xiàn)了陰道、宮頸管、輸卵管、子宮腔甚至是腹膜液中微生物的存在。該研究共收集了110例育齡女性不同生殖道部位的樣本，通過16SrRNA測序發(fā)現(xiàn)，陰道中的標(biāo)志物種是惰氏乳酸桿菌和卷曲乳酸桿菌。在輸卵管中，主要發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬、丹毒絲菌屬以及費克藍(lán)姆菌屬的存在。在腹膜液中則存在較多的標(biāo)志菌，如假單胞菌屬、摩根菌屬、鞘脂菌屬以及漫游球均屬。而在宮頸和子宮內(nèi)膜中也發(fā)現(xiàn)了許多微生物的存在，但還無法確定核心微生物[2]。盡管已經(jīng)有許多生殖道微生物紊亂導(dǎo)致女性生育力下降的證據(jù)，但近年來，有研究發(fā)現(xiàn)陰道菌群和子宮內(nèi)膜菌群與輔助生殖中反復(fù)著床失敗的發(fā)生有一定的關(guān)系，或能成為預(yù)測輔助生殖妊娠結(jié)局的重要指標(biāo)[3-4]。因此，本文將就女性生殖道微生物包括陰道菌群以及子宮內(nèi)膜菌群紊亂與著床失敗之間的關(guān)系和潛在的作用機制，以及有關(guān)生殖道微生物紊亂治療的研究進(jìn)展作一綜述。

1 陰道菌群與反復(fù)著床失敗的關(guān)系

眾所周知，乳酸桿菌是育齡期女性陰道內(nèi)定植優(yōu)勢菌，其中卷曲乳酸桿菌、惰性乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌和加氏乳酸桿菌是主要的類型。乳酸桿菌通過分解陰道內(nèi)糖原產(chǎn)生乳酸，保持陰道內(nèi)pH值在3.8～4.4之間，并且能協(xié)同其他的抗菌物質(zhì)形成防御系統(tǒng)，抵抗病原體入侵，保持陰道內(nèi)環(huán)境的健康[5]。陰道菌群特征并非一成不變，容易受到如運動量、飲食、月經(jīng)周期、促排卵方案、激素藥物等的影響，因此陰道菌群是因人而異，甚至隨著時間改變能在同一人體內(nèi)發(fā)生變化[6-7]。陰道菌群組成成分的變化，尤其是乳酸桿菌物種含量的改變，與女性生殖健康息息相關(guān)。

采集34例擬行輔助生殖助孕患者的月經(jīng)周期第21天陰道分泌物，進(jìn)行微生物檢測及隨訪其輔助生殖助孕的妊娠結(jié)局。結(jié)合陰道微生物組成與助孕的妊娠結(jié)局發(fā)現(xiàn)，助孕后成功妊娠者與助孕失敗者的陰道微生物組成之間存在顯著差異。4例成功妊娠婦女的陰道菌群主要包括惰性乳酸桿菌和卷曲乳酸桿菌兩種優(yōu)勢菌，而在其他助孕失敗的患者中則有更豐富的陰道生態(tài)系統(tǒng)，以及更大的微生物多樣性[8]。有研究通過檢測胚胎移植當(dāng)日的陰道菌群發(fā)現(xiàn)，當(dāng)陰道中乳酸桿菌比例減少或陰道微生態(tài)紊亂時，會降低胚胎著床率和妊娠率[3]。2019年，一項研究發(fā)現(xiàn)，在RIF組中以陰道乳酸桿菌作為優(yōu)勢菌的患者比例減少，但是和對照組相比并無顯著差異[9]。然而，2020年Fu等[4]通過16SrRNA測序發(fā)現(xiàn)，不明原因RIF患者的陰道乳酸桿菌與妊娠率呈顯著正相關(guān)，微生物α多樣性高于對照組，但惰性乳酸桿菌豐度明顯低于對照組，見圖1。這些證據(jù)都表明了陰道菌群確實能影響胚胎著床，但是仍需擴大樣本量進(jìn)一步明確陰道菌群能否成為預(yù)測胚胎著床的指標(biāo)。

陰道含有許多免疫相關(guān)的細(xì)胞和受體，能感受和監(jiān)督陰道環(huán)境的改變。當(dāng)陰道菌群紊亂時，一些與非乳酸桿菌陰道菌群群相關(guān)的物種可能會引發(fā)免疫反應(yīng)并降解宿主黏膜，增加感染的易感性，并導(dǎo)致不孕不育或早產(chǎn)等不良的妊娠結(jié)局。有研究通過構(gòu)建陰道上皮和陰道菌群共培養(yǎng)的3D模型后發(fā)現(xiàn)，阿托波氏菌能增加陰道上皮膜相關(guān)黏液，引發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，增加與破壞陰道屏障相關(guān)的細(xì)胞因子和抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)表達(dá)，如CCL20，hBD-2，白介素(IL)-1β,-6,-8和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá)的改變,從而影響女性生殖健康[10]。女性生殖道中，AMPs在屏障功能和宿主防御中起著關(guān)鍵作用，能調(diào)節(jié)下生殖道的陰道菌群，防止下生殖道微生物進(jìn)入上生殖道[11]。異常的陰道菌群如阿托波氏菌、加德納菌等能產(chǎn)生生物膜，導(dǎo)致乳酸桿菌無法定植到腔上皮表面，減少乳酸的表達(dá)，同時能導(dǎo)致如HBD2、HE4、CCL20、SLPI、HLPN1-3等抗菌肽的異常表達(dá)，間接影響著床的過程，導(dǎo)致胚胎著床的失敗[11]。此外，F(xiàn)u等[4]研究還發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，2',3環(huán)狀UMP和磷酸二醇是RIF組中含量較高的兩種代謝物，而甘油磷脂和苯吡喃是RIF組中含量較低的兩種重要代謝物，這兩種代謝物對著床和維持妊娠都具有重要的意義。苯吡喃作為一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，能影響子宮內(nèi)膜容受性，在RIF患者中表達(dá)量明顯降低[12]。RIF患者陰道代謝物組成的變化可能是由微生物組成變化所致，這可能是導(dǎo)致RIF發(fā)病的重要機制之一[4]。然而，目前陰道菌群對胚胎著床的作用機制復(fù)雜且還未完全明確，仍需進(jìn)一步建立更加完善的陰道-內(nèi)膜-微生物的模型，動物模型和臨床試驗以證實陰道菌群對胚胎著床的影響和機制。

圖1 反復(fù)著床失敗患者陰道及子宮菌群的改變及其潛在機制示意圖

2 子宮內(nèi)膜菌群與反復(fù)著床失敗的關(guān)系

隨著細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)及高通量測序的發(fā)展，子宮內(nèi)存在微生物已被普遍接受[13]。Moreno等研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜液中存在多種微生物甚至包含一些在陰道中未被發(fā)現(xiàn)的微生物，子宮內(nèi)膜液中的微生物種類明顯比陰道菌群中多，這也證實了子宮內(nèi)膜本身就存在定植微生物，并非完全是陰道菌群的延續(xù)[9,13]。然而，目前還未發(fā)現(xiàn)核心子宮內(nèi)膜菌群,而是將子宮內(nèi)膜菌群分為正常共生菌群和致病的異常菌群。在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密連接形成完整的屏障以及黏液中抗菌肽的作用下，正常的共生微生物一般不會產(chǎn)生有害的影響,甚至可保護(hù)子宮內(nèi)膜和促進(jìn)子宮內(nèi)膜發(fā)育，而異常的致病菌則可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜功能受損引起子宮內(nèi)膜炎癥、著床失敗和不孕的發(fā)生[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜定植了除乳酸桿菌以外的其他多種微生物時，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[8]。一項研究收集了33例不同種族患者在胚胎移植當(dāng)日的內(nèi)膜微生物，分析發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜菌群由278個屬組成，其中黃質(zhì)菌屬和乳酸桿菌是最豐富的屬[15]。研究還發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜菌群在胚胎圍著床期處于高度穩(wěn)定的狀態(tài)，但是一旦宮腔菌群組成改變或失調(diào),則會使非乳酸桿菌為主的其他菌種增加，而以非乳酸桿菌為主(Non-Lactobacillus dominated,NLDM，<90%乳酸桿菌屬，>10%的其他菌屬)的患者相比于以乳酸桿菌為主(Lactobacillus dominated,LDM,>90%乳酸桿菌屬)的患者，其胚胎著床率、臨床妊娠率以及活胎率明顯降低[13]。一項研究納入了92例擬進(jìn)行體外授精的不孕患者，通過檢測患者子宮內(nèi)膜液微生物的改變，進(jìn)一步證實不孕癥患者子宮內(nèi)膜菌群主要以非乳酸桿菌(NLDM)為主，并且發(fā)現(xiàn)提高子宮內(nèi)膜乳酸桿菌含量可能有利于NLDM不孕患者的著床[16]。此外，Kitaya等在RIF患者的子宮內(nèi)膜液中發(fā)現(xiàn)了伯克霍爾德菌屬，而對照組并未發(fā)現(xiàn)。該研究還發(fā)現(xiàn)，RIF組相比于對照組，加德納菌的檢出率增加[9]。通過檢測子宮內(nèi)膜組織及宮腔灌洗液中的微生物發(fā)現(xiàn)，透析菌、雙歧桿菌、普氏菌、加德納菌和厭氧球菌等18種微生物在慢性子宮內(nèi)膜炎中的豐度增高[17]。宮腔鏡下診斷為慢性子宮內(nèi)膜炎的RIF患者，經(jīng)抗生素治療后，其著床率和持續(xù)妊娠率明顯增加[18]。因此，子宮內(nèi)膜微生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的慢性子宮內(nèi)膜炎或許是降低子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致反復(fù)著床失敗發(fā)生的重要原因之一。微生物的相關(guān)治療或能改善反復(fù)著床失敗及輔助生殖的妊娠結(jié)局，但仍需要更多的臨床證據(jù)證實。

2.1 子宮內(nèi)膜微生物與免疫應(yīng)答 人體子宮內(nèi)膜是天生免疫防御的重要部位，包含了大量的免疫細(xì)胞(NK細(xì)胞，T細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等)，能分泌各種免疫分子和細(xì)胞因子，在胚胎著床、內(nèi)膜蛻膜化及維持妊娠中有重要的作用[19]。因此，子宮內(nèi)膜菌群或能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，改變子宮內(nèi)膜容受性，影響胚胎著床和妊娠。

有研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜的微生物擬桿菌中含有多糖A,可調(diào)節(jié)Th17的反應(yīng)，促進(jìn)CD4+Th1細(xì)胞的表達(dá)[20]。Th1細(xì)胞分泌的干擾素IFN-γ，IL-12和TNF-β,Th17細(xì)胞分泌的IL-17和IL-22等細(xì)胞因子，以及一些共生微生物如乳酸桿菌等能募集調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)，從而激活巨噬細(xì)胞，增強炎癥反應(yīng)，對妊娠起著重要作用[21]。目前，大部分研究集中于微生物與T細(xì)胞的相關(guān)性。然而，有研究發(fā)現(xiàn)81.7%的RIF患者表現(xiàn)出子宮內(nèi)膜免疫特征的異常，其中包括子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞的動員、激活和成熟的異常[22]。在伴有慢性子宮內(nèi)膜炎的RIF患者中，子宮內(nèi)膜CD68+巨噬細(xì)胞,CD83+成熟樹突狀細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞和Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)明顯上升，而經(jīng)抗生素治療后，這些細(xì)胞比例明顯下降[23]。因此，需要進(jìn)一步的研究以評估RIF患者的子宮內(nèi)膜菌群與uNK之間的關(guān)系，以及進(jìn)一步明確子宮內(nèi)膜菌群與子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞之間的關(guān)系和互相作用機制。

2.2 子宮內(nèi)膜菌群與炎癥因子 微生物通過模式識別受體(recognition receptors,PRRs)感應(yīng)病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，如Toll樣受體(TLRs)、RIG-I樣受體、NOD樣受體(NLRs)等。子宮內(nèi)膜可表達(dá)各種Toll樣受體(TLRs)1-10，在分泌階段增加，所有這些受體都能感知其特定的PAMP，并通過誘導(dǎo)信號級聯(lián)做出反應(yīng)[24]。內(nèi)膜上皮細(xì)胞經(jīng)脂多糖LPS刺激后，能激活線粒激活蛋白激酶(MAPK)和核因子(NF)-κB信號通路，促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8等促炎因子的表達(dá)[25]。衣原體定植的子宮內(nèi)膜能通過產(chǎn)生Pgp3蛋白與LL-37結(jié)合并形成穩(wěn)定的復(fù)合物，中和LL-37的抗衣原活性，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子在成纖維細(xì)胞/上皮細(xì)胞中的產(chǎn)生和炎癥細(xì)胞的招募[26]。此外，當(dāng)異常致病菌侵入時，能刺激宿主細(xì)胞促進(jìn)AMP分泌，抵御病原體入侵子宮內(nèi)膜上皮[11]。然而，有研究通過比較NLDM和LDM患者子宮內(nèi)膜中的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在含惰性乳酸桿菌的LDM患者中發(fā)現(xiàn)了低水平的β-防御素、cathelicidin和IL-1β，但是并無顯著意義[27]。因此，仍需進(jìn)一步的研究以明確子宮內(nèi)膜菌群炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。

微生態(tài)紊亂引起的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)及其之間的相互作用既可直接影響胚胎著床的過程，也能通過影響子宮內(nèi)膜容受性間接導(dǎo)致著床失敗(圖1)。目前有許多關(guān)于子宮內(nèi)膜菌群影響著床和妊娠的假設(shè)，但是具體的作用機制尚未被明確闡述，因此仍需更深入和系統(tǒng)的研究。

3 生殖道菌群紊亂的治療

有研究發(fā)現(xiàn)，通過聯(lián)合使用抗生素和益生菌治療細(xì)菌性陰道炎，能重塑陰道微生態(tài)的平衡，增加乳酸桿菌的含量[28]。將鼠李糖乳酸桿菌BPL005和正常育齡女性的原代內(nèi)膜上皮共培養(yǎng)，其可產(chǎn)生乳酸等相關(guān)的有機酸，降低生殖道PH，還能降低IL-6、IL-8和MSP-1等水平的表達(dá)，增加IL-1RA和IL-1β的表達(dá)。當(dāng)有異常致病菌存在時，這些因子表達(dá)的改變更加明顯。最后，通過對鼠李糖乳酸桿菌BPL005進(jìn)行局部淋巴結(jié)檢測、陰道刺激測試及過敏性接觸性皮炎測試發(fā)現(xiàn)沒有細(xì)胞毒性的潛在跡象[29]。這些證據(jù)證實了鼠李糖乳酸桿菌BPL005的安全性和有效性，或能成為潛在的抗生素替代治療方案和重要的臨床輔助治療。

此外，研究發(fā)現(xiàn)1例子宮內(nèi)膜菌群主要以鏈球菌為主的RIF患者通過阿莫西林以及乳鐵蛋白的治療后，內(nèi)膜菌群轉(zhuǎn)為以乳酸桿菌為主的內(nèi)膜環(huán)境。雖然該患者最終并未獲得妊娠，但是其他NLDM患者通過抗生素聯(lián)合益生元/益生菌治療后，轉(zhuǎn)為以乳酸桿菌為主的內(nèi)膜環(huán)境后，最終成功獲得妊娠[16]。Carlos等研究團隊通過持續(xù)跟蹤1例反復(fù)妊娠失敗的患者發(fā)現(xiàn)，加德納菌定植的內(nèi)膜，可能會對甲硝唑的標(biāo)準(zhǔn)治療產(chǎn)生耐藥。由于加德納菌感染的臨床病程多變，容易反復(fù)發(fā)作，經(jīng)反復(fù)抗生素聯(lián)合益生菌的治療，最終也并未改善妊娠結(jié)局[30]。由于臨床上一部分患者即使預(yù)防性使用抗生素后，妊娠結(jié)局也無突破性改變。此外，不同微生物具有不同特性，經(jīng)驗性用藥或使用廣譜抗生素有時非但不能改善妊娠結(jié)局，反而容易導(dǎo)致耐藥性等問題，所以在臨床上需謹(jǐn)慎使用抗生素治療。因此，找到關(guān)鍵致病微生物及其致病機制，進(jìn)行針對性治療非常關(guān)鍵。此外，仍需更多的臨床試驗和基礎(chǔ)研究以進(jìn)一步探索合適的益生菌聯(lián)用抗生素方案或合適的益生菌/益生元替代治療方案，從而改善內(nèi)膜微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)胚胎著床及改善妊娠結(jié)局。

總之，本文分別總結(jié)了陰道菌群和子宮內(nèi)膜菌群與反復(fù)著床失敗發(fā)生的關(guān)系及其潛在的作用機制，以及總結(jié)了生殖道微生物紊亂尤其是內(nèi)膜菌群紊亂的相關(guān)治療進(jìn)展。盡管目前有許多研究已證實了女性生殖道微生態(tài)紊亂與胚胎著床的過程密切相關(guān)，但是仍需更大樣本量的臨床研究以改善這一領(lǐng)域的知識，以及深入基礎(chǔ)研究以闡明菌群之間的關(guān)系及其作用機制，為今后關(guān)于個體菌群的研究以及為臨床上不孕和反復(fù)著床患者的治療提供更有效和準(zhǔn)確的信息。