朱盛蘭，張慧婷，江 一，陳玉婷，韋麗杰，張婧怡，周 璇，馮 玲

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430000)

胎盤作為母親和胎兒之間唯一的交換器官，對妊娠和胎兒發(fā)育至關(guān)重要。胎盤發(fā)育包括子宮螺旋動脈的重鑄，依賴滋養(yǎng)細(xì)胞在嚴(yán)格時空控制下的分化、增殖、遷移和侵襲[1]。胎盤發(fā)育異常與子癇前期、早產(chǎn)、流產(chǎn)和胎兒生長受限等多種妊娠疾病息息相關(guān)[2]。SIRT3，即沉默信息調(diào)節(jié)因子3(silence information regulator 3)，它是由核基因組編碼的一種去乙?；?。作為Sirtuins家族的一員，SIRT3這一線粒體高保真蛋白在許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。SIRT3可通過去乙?；揎椂喾N線粒體蛋白，影響線粒體形態(tài)與功能，參與調(diào)節(jié)能量代謝、ROS清除、細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、侵襲以及遷移、細(xì)胞衰老等[3-4]。SIRT3也已被證實(shí)與衰老、神經(jīng)退行性變、肝病、腎病、心臟病以及其他代謝性疾病相關(guān)[5]。SIRT3主要存在于肝臟、心臟及腎臟等富含線粒體、新陳代謝旺盛的器官。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3在子癇前期患者胎盤中表達(dá)降低，但是關(guān)于胎盤組織SIRT3蛋白的時空表達(dá)和細(xì)胞定位尚無報(bào)道[6-7]。本研究應(yīng)用免疫組化法和免疫印跡法研究SIRT3在早、中、晚孕期人胎盤組織中的定位以及表達(dá)，并初步探討其在胎盤發(fā)育中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 所用樣本組織采集于2019年3月至2019年12月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院終止妊娠的患者。其中早孕期絨毛組織10例，取自因社會因素行負(fù)壓吸引術(shù)人工流產(chǎn)的孕婦，孕周6～10周。中孕期胎盤組織9例，取自胎膜早破或?qū)m頸機(jī)能不全所致流產(chǎn)者，孕周18～27周。晚孕期胎盤組織15例，取自單胎妊娠因合并子宮瘢痕或頭盆不稱及胎位異常行剖宮產(chǎn)者，孕周37～39周。絨毛、蛻膜及胎盤組織用無菌PBS清洗干凈，一部分分裝后于-80℃凍存，一部分用多聚甲醛固定，梯度酒精脫水后用石蠟包埋并切片。研究對象均無高血壓、糖尿病、甲狀腺疾病史，無家族遺傳病史、感染性疾病及心血管疾病，無不良孕產(chǎn)史和孕期藥物服用史。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，參與者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和材料 人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系 HTR-8/SVneo(ACTT)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；青鏈霉素、0.25%胰酶、免疫組化試劑盒(武漢Servicebio公司)；Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；si-SIRT3及其非特異性陰性對照si-NC(廣州RiboBio公司)；逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒(南京Vazyme公司)；MatrigelTM基質(zhì)膠(美國BD公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；RIPA裂解液、SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海Beyotime公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Advansta公司)；兔抗人SIRT3單克隆抗體、鼠抗人CK7單克隆抗體(英國Abcam公司)；鼠抗人β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(美國Abbkine公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 組織蠟塊連續(xù)切片，常規(guī)烘片、二甲苯脫蠟及梯度酒精水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸修復(fù)液(pH=6.0)高溫抗原修復(fù)，冷卻至室溫，山羊血清封閉，滴加一抗(SIRT3，1∶100稀釋；CK7，1∶200稀釋)，PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜。第二天復(fù)溫PBS洗滌，滴加二抗工作液孵育30min。顯微鏡下DAB顯色，雙蒸水終止顯色。蘇木素染核，0.1%鹽酸分化，雙蒸水沖洗后返藍(lán)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察并取不同視野拍照。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HTR-8/SVneo細(xì)胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，加1%青鏈霉素，置5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每兩天換液1次，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，將細(xì)胞按4×105/孔接種至六孔板。六孔板中細(xì)胞密度達(dá)50%～60%時，按Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為si-NC、si-SIRT3-1、si-SIRT3-2及si-SIRT3-3四個組，轉(zhuǎn)染后48h，采用qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴(kuò)增體系(10μL)：cDNA 1.0μL，上、下游引物各0.5μL，三蒸水3.0μL，SYBR Green Real time PCR Mix 5.0μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10min，變性95℃ 2s，退火60℃ 20s，延伸70℃ 10s，40個循環(huán)。引物序列：SIRT3上游為5'-GCTCTACACGCAGAACATCG-3'，下游為5'-CATCACGTCAGCCCGAAT-3'。β-actin上游為5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游為5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。采用2-△△CT相對定量法進(jìn)行分析。

1.3.4 Western blot法檢測蛋白表達(dá) RIPA裂解液(含1% PMSF)提取蛋白，BCA法測量蛋白濃度，加1/4體積Loading buffer煮沸。按30μg/孔上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白分子量切膠，冰浴下300mA恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5% BSA封閉1h，4℃搖床孵育一抗過夜。次日復(fù)溫TBST洗膜，室溫?fù)u床上孵育二抗1h。TBST洗膜3次后采用ECL法顯影曝光。Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸為2×105/mL的細(xì)胞懸液。Transwell小室下室加600μL含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，向鋪好基質(zhì)膠(Matrigel基質(zhì)膠：無血清培養(yǎng)基=1∶7)的小室上室均勻滴加100μL的混勻細(xì)胞懸液。37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36h。取出小室，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，棉棒擦去上室面細(xì)胞。PBS洗滌晾干，顯微鏡下取6個視野拍照計(jì)數(shù)。Image J統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)并取平均值。每次實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個復(fù)孔，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 六孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h，待細(xì)胞貼壁生長至80%時用200μL的槍頭進(jìn)行劃痕，PBS輕柔清洗2遍后向六孔板中加2mL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，劃痕后0h和24h在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移狀態(tài)，并取6個視野每次于相同位置拍照。使用Image J分析。每次實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個復(fù)孔，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 SIRT3在早、中、晚孕期人胎盤組織中的定位 用細(xì)胞角蛋白7(CK7)來標(biāo)記滋養(yǎng)細(xì)胞。免疫組化結(jié)果表明，妊娠期各階段胎盤組織均有SIRT3蛋白的表達(dá)，且部位大體相同，主要分布于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(CTB)、合體滋養(yǎng)細(xì)胞(STB)和間質(zhì)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(iEVT)的細(xì)胞漿，在一些基質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)但顯色較弱，見圖1。

圖1 SIRT3在人胎盤組織中的表達(dá)模式(40×)A～C：SIRT3陽性染色在CTB、STB和iEVT中較強(qiáng)，而在基質(zhì)細(xì)胞中顯色較弱;E～G：CK7染色，用于標(biāo)記胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞;D和H：陰性對照;▲:指向間質(zhì)細(xì)胞；AV：錨定絨毛；FV：游離絨毛；STB：合體滋養(yǎng)細(xì)胞；CTB：細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞；iEVT：間質(zhì)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞

2.2 SIRT3在早、中、晚孕期人胎盤組織中的表達(dá) Western blot結(jié)果表明，孕晚期胎盤組織中SIRT3蛋白的表達(dá)水平顯著低于孕早、中期(P<0.05)，而早孕期和中孕期胎盤組織SIRT3蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)，見圖2。

圖2 Western blot法檢測人胎盤組織SIRT3蛋白表達(dá)*P<0.05

2.3 si-SIRT3對細(xì)胞中SIRT3的干擾效率 設(shè)計(jì)并合成3種不同的siRNA(si-SIRT3-1、si-SIRT3-2和si-SIRT3-3)，分別靶向SIRT3 mRNA的3個不同位點(diǎn)。通過Western blot和qRT-PCR對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，si-SIRT3-1可顯著下調(diào)HTR-8/SVneo細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，見圖3。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取si-SIRT3-1對HTR-8/SVneo細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并將其簡寫為si-SIRT3。

圖3 Western blot法和qRT-PCR法檢測各組細(xì)胞中SIRT3表達(dá)水平*P<0.05 vs si-NC

2.4 下調(diào)SIRT3表達(dá)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞遷移 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-SIRT3組細(xì)胞遷移能力顯著低于si-NC組(P<0.05)，見圖4。表明下調(diào)SIRT3表達(dá)后，顯著抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移能力。

圖4 敲低SIRT3基因后細(xì)胞遷移能力的變化*P<0.05

2.5 下調(diào)SIRT3表達(dá)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-SIRT3組細(xì)胞侵襲能力顯著低于si-NC組(P<0.05)，見圖5。表明下調(diào)SIRT3表達(dá)后，顯著抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲能力。

圖5 敲低SIRT3基因后細(xì)胞侵襲能力的變化*P<0.05

3 討 論

胎盤起源于滋養(yǎng)外胚層，在妊娠早期迅速發(fā)育，其結(jié)構(gòu)和功能也發(fā)生動態(tài)改變[8]。在人胎盤發(fā)育過程中，滋養(yǎng)外胚層中原始的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，以兩條主要路徑發(fā)生分化。一種分化路徑為在漂浮絨毛(floating villi，F(xiàn)V)表面，單核的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(cytotrophoblast，CTB)融合為多核的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞(syncytiotrophoblast，STB)。FV懸浮于充滿母體血液的胎盤絨毛間隙，其表面的STB主要負(fù)責(zé)母胎界面間的物質(zhì)交換、分泌妊娠相關(guān)活性物質(zhì)以及抵御外來微生物等。另外一條路徑中，原始細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生增殖，形成錨定于母體子宮壁的錨定絨毛(anchoring villi，AV)。AV中的CTB可獲得侵襲性表型，分化為侵入蛻膜或部分子宮肌層的間質(zhì)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(interstitial extravillous trophoblast，iEVT)，或者位于血管內(nèi)能重塑母胎界面血管系統(tǒng)的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(endovascular extravillous trophoblast，enEVT)[9]。妊娠第6～20周，EVT的侵襲性及對子宮螺旋動脈的重塑活動最為活躍。這兩條分化途徑均受到母胎界面氧張力、激素、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子及其他信號分子相互作用網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)格控制[10]。

大量的研究證實(shí)，胎盤發(fā)育異常與流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒生長受限和子癇前期等多種病理妊娠息息相關(guān)[11-13]。因此明確胎盤發(fā)育過程中的滋養(yǎng)細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制，對胎盤源性疾病的早期診斷、治療乃至預(yù)防都極為重要。通常，研究人員收取早、中、晚孕期正常胎盤組織，采用免疫組化、免疫印跡或免疫熒光法等檢測某種分子在人類胎盤組織的時空表達(dá)模式。有研究發(fā)現(xiàn)，ESRP1在早、中孕期表達(dá)水平的降低驅(qū)動CTB向EVT的分化，且ESRP1負(fù)性調(diào)控EVT遷移和侵襲能力[14]；vWF裂解酶ADAMTS13在中、晚孕期表達(dá)顯著下降，調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能和胎盤血管的生成，參與PE的發(fā)病[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期各階段胎盤組織SIRT3的時空表達(dá)模式。免疫組化結(jié)果表明，SIRT3在早、中、晚孕期胎盤組織中均有表達(dá)，主要存在于CTB、STB以及iEVT的細(xì)胞漿，而在基質(zhì)細(xì)胞中染色較弱。Western blot結(jié)果顯示，SIRT3在晚孕期胎盤組織中的表達(dá)水平低于早、中孕期。既往研究發(fā)現(xiàn)，妊娠第6～20周之間胎盤組織滋養(yǎng)細(xì)胞具有較強(qiáng)侵襲和遷移能力，當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能障礙時胎盤發(fā)育異常，誘發(fā)胎盤源性疾病的發(fā)生[16]。因此，本研究提示SIRT3妊娠期表達(dá)水平的動態(tài)改變可能是通過調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能參與胎盤發(fā)育。

SIRT3在不同癌癥發(fā)展中扮演抗癌或促癌基因雙重角色[17]。如SIRT3介導(dǎo)的ROS控制可抑制Src/FAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，SIRT3的過表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移[18]。此外，SIRT3介導(dǎo)的SOD2激活可促進(jìn)三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[19]。在宮頸癌細(xì)胞中，SIRT3去乙?；阴］o酶A羧化酶(ACC1)以促進(jìn)脂質(zhì)代謝。這種脂肪酸代謝的重新編程促進(jìn)了癌癥的遷移和侵襲[20]。以上研究表明，SIRT3可能通過影響腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。滋養(yǎng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞具有類似的生物學(xué)功能，推測SIRT3可能同樣影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲遷移。本研究使用siRNA干擾HTR-8/SVneo細(xì)胞中SIRT3蛋白的表達(dá)，檢測其對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響。結(jié)果表明，SIRT3表達(dá)下調(diào)后，顯著抑制了HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移侵襲能力(P<0.05)，這與SIRT3在孕晚期胎盤組織中的表達(dá)水平低于早、中孕期相一致。

綜上所述，SIRT3在晚孕期胎盤組織中的表達(dá)水平低于早、中孕期胎盤組織，且SIRT3表達(dá)下調(diào)可抑制人絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo的遷移與侵襲能力，表明SIRT3可能是胎盤發(fā)育形成過程中不可缺少的調(diào)控因子。但SIRT3調(diào)控胎盤發(fā)育的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，且SIRT3與病理妊娠，如胎兒生長受限和子癇前期的關(guān)系還需深入探討。