張京業(yè),張曉麗,吳克良

[山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院)，濟(jì)南 250012]

臨床上，許多患者夫婦經(jīng)歷著反復(fù)著床失敗和早期流產(chǎn)的痛苦，而其所移植的胚胎有染色體異常，可能是造成這一結(jié)果的重要原因[1]。據(jù)研究，高齡患者卵子和胚胎的非整倍體率非常高[2]。事實(shí)上，40歲以上患者體外獲取的卵子50%以上都是非整倍體[3]。胚胎植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing for aneuploidies，PGT-A)通常被用于篩選染色體正常胚胎進(jìn)行移植，從而改善輔助生殖結(jié)局[4]。胚胎活檢是進(jìn)行PGT-A的重要前提。胚胎活檢可在不同的胚胎發(fā)育階段進(jìn)行，目前常用的活檢時(shí)期包括卵裂期活檢[5]，極體活檢[6]，桑椹胚活檢[7]以及囊胚期活檢[8]。囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢由于其對(duì)胚胎的低損傷以及低嵌合性，是廣泛應(yīng)用的活檢時(shí)期[9-10]。常規(guī)的PGT-A周期中，取卵后第五天(D5)或第六天(D6)進(jìn)行的是新鮮囊胚活檢。待囊胚發(fā)育到適合冷凍時(shí)，取部分滋養(yǎng)層細(xì)胞行染色體檢測(cè)，該枚囊胚則需冷凍保存。若染色體結(jié)果正常，則該枚囊胚可被解凍并移植。然而在常規(guī)體外授精(in vitro fertilization,IVF)/胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)周期中，有些患者因反復(fù)著床失敗、反復(fù)流產(chǎn)或流產(chǎn)物基因檢測(cè)有異常而被臨床大夫診斷為需進(jìn)行胚胎遺傳學(xué)篩查。如這些患者本周期還有剩余冷凍囊胚，則應(yīng)將這些冷凍囊胚做遺傳學(xué)篩查。而此時(shí)新鮮囊胚活檢方法將不再適用，需將冷凍囊胚先解凍復(fù)蘇，再進(jìn)行囊胚活檢，這種方法稱之為凍胚活檢法。相比較于鮮胚活檢法，凍胚活檢法增加了一次胚胎冷凍和復(fù)蘇的過程。本研究旨在研究?jī)雠呋顧z法增加的胚胎冷凍和復(fù)蘇過程是否會(huì)對(duì)胚胎活檢的效率和結(jié)果產(chǎn)生影響，探討凍胚活檢法對(duì)胚胎潛在的損傷和移植結(jié)局的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧分析2016年1月至2018年12月在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院就診的患者。實(shí)驗(yàn)組共納入96例患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：助孕方式為IVF或ICSI；移植后出現(xiàn)胚胎停育且流產(chǎn)物的基因檢測(cè)有異常，或有3次及以上的著床失敗、早期流產(chǎn)；有剩余冷凍囊胚；醫(yī)患溝通后患者要求將剩余囊胚行PGT-A檢測(cè)。對(duì)照組為同一天進(jìn)行囊胚活檢的104例常規(guī)PGT-A患者,患者夫妻雙方染色體沒有異常，其行PGT-A的指征包括高齡、反復(fù)種植失敗，反復(fù)流產(chǎn)及胚胎停育且流產(chǎn)物的基因檢測(cè)有異常。對(duì)照組(鮮胚活檢組):即常規(guī)的PGT-A周期，其流程為“活檢-冷凍-復(fù)蘇-移植”。實(shí)驗(yàn)組(凍胚活檢組)，其具體流程為“冷凍-復(fù)蘇-活檢-冷凍-復(fù)蘇-移植”。

1.2 囊胚冷凍復(fù)蘇以及活檢

1.2.1 囊胚解凍 凍存的囊胚采用玻璃化解凍程序(K-SIBW-5000，COOK公司)進(jìn)行解凍。

1.2.2 囊胚活檢 實(shí)驗(yàn)組囊胚活檢流程：等復(fù)蘇的囊胚擴(kuò)張后，用適當(dāng)?shù)募す饽芰繉?duì)囊胚進(jìn)行簡(jiǎn)單皺縮，后用較小的激光能量對(duì)活檢位置的透明帶進(jìn)行開縫。隔著透明帶上的縫隙，利用負(fù)壓將所要活檢的滋養(yǎng)層細(xì)胞吸入活檢針，再用激光沿著透明帶和活檢針的交接處切割滋養(yǎng)層，最后完全分離所需要的滋養(yǎng)層細(xì)胞[11]。將活檢的組織送去做PGT-A檢測(cè)。對(duì)照組囊胚活檢流程：將D5/D6完全擴(kuò)張的囊胚經(jīng)上述方法活檢，活檢的組織送去做PGT-A檢測(cè)。

1.2.3 囊胚冷凍 活檢后的囊胚采用玻璃化冷凍程序(K-SIBV-5000，COOK公司)進(jìn)行冷凍保存。

1.2.4 囊胚移植 待胚胎染色體檢測(cè)結(jié)果出來后，經(jīng)遺傳咨詢后選取染色體正常的囊胚進(jìn)行移植。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件，連續(xù)性參數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，比值類數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 凍胚活檢組與鮮胚活檢組的基本概況 凍胚活檢組96例患者共冷凍452枚囊胚，除去本周期之前移植的82枚，共370枚囊胚參與本研究。鮮胚活檢組104例患者的328枚囊胚均參與了本研究。圖1展示了兩個(gè)組胚胎從活檢到移植的基本流程。

圖1 凍胚活檢組與鮮胚活檢組的基本概況

2.2 凍胚活檢組與鮮胚活檢組囊胚解凍后的存活情況 凍胚活檢組與鮮胚活檢組患者的年齡、PGT-A指征、活檢囊胚數(shù)、囊胚評(píng)分、第二次解凍存活率以及總的解凍存活率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組胚胎冷凍復(fù)蘇后的存活率比較

2.3 凍胚活檢組與鮮胚活檢組胚胎移植后的臨床結(jié)局 凍胚活檢組的96例患者中，76例存在染色體正常的胚胎，并進(jìn)行了一次或多次移植，最終53例獲得了活產(chǎn)結(jié)局。鮮胚活檢組的104例患者中，74例進(jìn)行了移植，最終49例獲得了活產(chǎn)結(jié)局。兩組的平均移植次數(shù)和活產(chǎn)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組胚胎移植后的著床率(P=0.630)和流產(chǎn)率(P=0.985)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凍胚活檢組胚胎染色體的整倍體率顯著高于鮮胚活檢組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)。見表2。

表2 凍胚活檢組與鮮胚活檢組臨床結(jié)局的比較

3 討 論

本文中凍胚活檢組對(duì)應(yīng)的是IVF/ICSI周期，鮮胚活檢組對(duì)應(yīng)的是PGT-A周期,兩組的胚胎培養(yǎng)過程完全一致。而囊胚的冷凍、解凍和移植操作都有成熟的體系和操作規(guī)程，由經(jīng)驗(yàn)豐富的胚胎學(xué)家進(jìn)行操作。囊胚的活檢操作、活檢時(shí)機(jī)的把握均由實(shí)驗(yàn)室頂級(jí)胚胎學(xué)家來完成，而且本研究中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組囊胚的活檢是在同一天由同一位胚胎學(xué)家完成的,最大限度減少了兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異性。本文中兩組活檢的囊胚均達(dá)到了冷凍標(biāo)準(zhǔn)。囊胚評(píng)分采用Gardner法[12]，只有評(píng)分為(4～6)BC以及以上(AA,BA,AB,BB)的囊胚才符合標(biāo)準(zhǔn)。胚胎評(píng)分是由本實(shí)驗(yàn)室有著豐富胚胎評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的胚胎學(xué)家完成的，使得胚胎質(zhì)量不會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜上所述，與鮮胚活檢組相比，凍胚活檢組的特殊性僅為增加了一次囊胚冷凍和復(fù)蘇的過程。

凍胚活檢的方法能得以進(jìn)行，一個(gè)重要的前提就是胚胎活檢方法的改進(jìn)。本中心的吳克良首次提出了非提前打孔囊胚活檢法[11]，該方法針對(duì)四期囊胚，利用激光打孔及透明帶的束縛作用，迅速地完成滋養(yǎng)層組織的活檢，大大減少了對(duì)囊胚發(fā)育的干預(yù)。這種新的活檢方法應(yīng)用到凍胚活檢，只需在復(fù)蘇的囊胚充分復(fù)張后就可進(jìn)行活檢，極大提高了活檢的靈活性。

凍胚活檢法針對(duì)的是IVF/ICSI周期中有剩余冷凍囊胚，但因反復(fù)種植失敗或流產(chǎn)物基因檢測(cè)有異常等，而符合PGT-A指征的患者。它使得這類患者的剩余冷凍囊胚得以利用，在一定程度上避免了開始新的PGT-A周期對(duì)患者身體以及經(jīng)濟(jì)上的損害。

凍胚活檢方法可能存在潛在的缺陷。常規(guī)的PGT-A技術(shù)中囊胚活檢過程屬于侵入性操作，可能對(duì)胚胎活性產(chǎn)生影響。而之后的冷凍及復(fù)蘇過程都有可能造成囊胚的損傷甚至死亡。而凍胚活檢法對(duì)胚胎進(jìn)行兩次冷凍復(fù)蘇過程，可能會(huì)造成更多的囊胚死亡，同時(shí)存活的囊胚發(fā)育潛能也可能受到一定影響。然而，有文獻(xiàn)表明,合適的囊胚組織活檢對(duì)胚胎的損傷很小，基本不會(huì)造成囊胚的死亡[13-14]。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期以來的囊胚活檢操作結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

鮮胚活檢組中囊胚只進(jìn)行一次冷凍復(fù)蘇過程，將其作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)凍胚活檢組的總存活率為96.5%，與鮮胚活檢組的98.9%相比，沒有明顯降低。這與文獻(xiàn)報(bào)道的囊胚復(fù)蘇存活率高達(dá)95%以上相吻合[13,15]，因此認(rèn)為該方法對(duì)囊胚死亡率的影響可以接受。本研究結(jié)果顯示，凍胚活檢組與鮮胚活檢組的胚胎著床率和流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為凍胚活檢法對(duì)囊胚發(fā)育潛能的影響微乎其微。

本研究中兩組患者的平均年齡無差異，但均大于35歲。研究表明，胚胎非整倍體的比例在>35歲的患者中顯著提高[16]。因此，兩組患者行PGT-A檢測(cè)是有必要的。結(jié)果顯示，凍胚活檢組胚胎的整倍體率顯著高于鮮胚活檢組。表明本研究中IVF/ICSI周期的患者雖然做了PGT-A檢測(cè)，但仍未達(dá)到做常規(guī)PGT-A的標(biāo)準(zhǔn)。若需開始新的周期，則需綜合考慮多種因素來決定助孕方式。

綜上所述，通過回顧分析本中心2016～2018年凍胚活檢與鮮胚組活檢的結(jié)果，認(rèn)為本中心采用的凍胚活檢方法安全且有效。凍胚活檢法與鮮胚活檢法之間互為補(bǔ)充，為改善PGT-A患者的臨床結(jié)局作出重要貢獻(xiàn)。