王 學(xué)綜述, 任麗君, 張英為, 周玉皆審校

0 引 言

1961年Hayflick和Gil[1]觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正常人成纖維細(xì)胞連續(xù)傳代時，細(xì)胞分裂至一定代數(shù)也會發(fā)生停滯，并伴隨著表型改變，由此細(xì)胞衰老的概念第一次被正式提出。細(xì)胞衰老分為復(fù)制性衰老和過早性衰老，前者與端粒縮短相關(guān)，后者與壓力應(yīng)激誘因相關(guān)，主要包括線粒體功能障礙、抑癌基因的失活、氧化應(yīng)激、電離輻射或高氧等，大多數(shù)這些誘因?qū)е录?xì)胞DNA損傷或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，并且激活DNA損傷修復(fù)(DNA damage repair，DDR)反應(yīng)。通常，衰老細(xì)胞更多表達(dá)p21、p16、p53等因子并且出現(xiàn)永久的細(xì)胞周期停滯，被認(rèn)為受p53-p21-RB和p16通路的調(diào)節(jié)[2]。p53表達(dá)增加后通過p21上調(diào)細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子1A(Cyclin dependent protein kinase inhibitor 1A，CDKN1A)，CDKN1A使得磷酸化Rb蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榉橇姿峄疪b蛋白從而綁定轉(zhuǎn)錄因子E2F，細(xì)胞增殖周期進(jìn)入阻滯。細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase, CDK)和細(xì)胞周期蛋白Cyclin是細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用的兩類蛋白，p16抑制CDK/cyclin復(fù)合物活性阻止非磷酸化Rb和E2F分離介導(dǎo)細(xì)胞周期永久阻滯。除生長停滯外，衰老細(xì)胞還具有衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)，分泌多種促炎細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和金屬蛋白酶，以旁分泌和自分泌的方式參與細(xì)胞的生理病理過程[3]。細(xì)胞衰老與細(xì)胞代謝改變也有關(guān)，β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，SA-β-gal)在衰老細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。

1 細(xì)胞衰老的主要發(fā)生機(jī)制

眾多研究者發(fā)現(xiàn)多種因素均參與細(xì)胞衰老的發(fā)生。20世紀(jì)70年代端?？s短與細(xì)胞“末端復(fù)制問題”的聯(lián)系首次被發(fā)現(xiàn)[4]。隨后，多種研究證實(shí)端粒縮短可導(dǎo)致細(xì)胞DNA末端暴露引發(fā)DDR，細(xì)胞進(jìn)入衰老周期[5-7]。1989年Linnane等[8]發(fā)現(xiàn)由于線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)的修復(fù)機(jī)制有限，mtDNA會發(fā)生突變和缺失，是參與細(xì)胞衰老發(fā)生的主要靶標(biāo)。進(jìn)一步研究顯示，線粒體功能障礙還可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體活性氧(Reactive oxygen species, ROS)持續(xù)增加，使得mtDNA突變積累、氧化磷酸化、抗氧化防御能力受損加重DDR，增加細(xì)胞衰老的程度[9-10]。20世紀(jì)90年代，科學(xué)家紛紛探索細(xì)胞衰老與癌癥之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)抑癌基因失活后可使下游細(xì)胞DNA損傷、基因表達(dá)以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，還可激活細(xì)胞增殖阻滯通路，從而引起細(xì)胞衰老[11-12]。2007年He等[13]發(fā)現(xiàn)DNA損傷和致癌應(yīng)激還以p53依賴性方式強(qiáng)烈誘導(dǎo)miR-34a、miR-34b和miR-34c的表達(dá)，當(dāng)miR-34過表達(dá)時，細(xì)胞進(jìn)入衰老階段。隨后，深入研究顯示miRNA家族在控制和參與細(xì)胞衰老中均起著重要參與作用，且miRNA表達(dá)降低可減弱p53介導(dǎo)的細(xì)胞衰老[14-15]。近期，電離輻射(Ionizing radiation，IR)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的觀點(diǎn)得到眾多學(xué)者的認(rèn)同。已有研究表明，IR一方面會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA受損，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；另一方面，IR可誘導(dǎo)周圍正常細(xì)胞衰老，導(dǎo)致正常組織纖維化和器官功能障礙[16-19]。同時IR刺激免疫系統(tǒng)迅速消除這些衰老細(xì)胞，如果衰老細(xì)胞產(chǎn)量超過免疫系統(tǒng)清除能力或免疫系統(tǒng)受損而無法有效清除這些衰老細(xì)胞，則衰老細(xì)胞會積累[20-21]。

2 細(xì)胞衰老參與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生機(jī)制

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、不可逆和致命的進(jìn)行性纖維化間質(zhì)性肺疾病，約占所有間質(zhì)性肺疾病病例的20%[22]。其病理特征是肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells，AEC)反復(fù)被破壞引發(fā)彌漫性肺間質(zhì)纖維化，間質(zhì)組織瘢痕化增厚，病因和發(fā)病機(jī)制不明[23]?；颊呖杀憩F(xiàn)為咳嗽、氣喘、呼吸困難，最終呼吸衰竭、甚至死亡。IPF在診斷后平均中位生存期為3～5年[24]?，F(xiàn)有證據(jù)表明，IPF的發(fā)生率和患病率隨年齡上升成倍增長，是一種與衰老相關(guān)疾病[25]。然而，年齡相關(guān)的IPF易感性背后的機(jī)制仍不十分清楚，有待深入研究。

2.1端?？s短參與IPF的發(fā)生IPF與端?？s短有關(guān)，短端粒會導(dǎo)致染色體末端暴露，機(jī)體識別為DNA雙鏈斷裂并激活DDR[26]。研究人員基于PCR測量端粒長度和總膠原含量，與正常對照組相比，IPF患者中端粒長度縮短了約27%，總膠原含量卻大幅增加。在有遺傳性端粒功能障礙的小鼠中，對博來霉素(Bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的染色體損傷及肺纖維化表現(xiàn)有更高的敏感性[27]。人端粒結(jié)合因子TRF1(Telomere repeat binding factor 1，TRF1)為一種重要的端粒庇護(hù)蛋白。Ram等在小鼠II型AEC中發(fā)現(xiàn)，TRF1缺失會導(dǎo)致端?？s短和肺重構(gòu)，其特征在于肺泡間隔增厚、結(jié)構(gòu)變形、間質(zhì)膠原沉積、羥脯氨酸含量增加以及衰老相關(guān)SA-β-gal在肺泡上皮細(xì)胞中積累加劇。研究顯示II型AEC中TRF1的缺失導(dǎo)致肺纖維化的自發(fā)發(fā)展。ZCCHC8是脊椎動物的一種含鋅關(guān)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)端粒酶3'末端成熟。研究人員通過全基因組連鎖分析發(fā)現(xiàn)肺纖維化家庭中ZCCHC8的突變體(ZCCHC8部分丟失和完全丟失的兩種不同的RNA)失調(diào)性表型均發(fā)展為端粒酶RNA功能不全，導(dǎo)致端粒長度縮短。同時，他們還發(fā)現(xiàn)在8%～15%家族性IPF和其他11.3%IPF患者體中端粒酶有關(guān)的基因發(fā)生突變[28]。綜上所述，端粒縮短與IPF發(fā)生關(guān)系緊密。

2.2抑癌基因的下調(diào)參與IPF的發(fā)生Tian等[29]研究了IPF患者肺組織中PTEN/NF-κB的活化與細(xì)胞衰老之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在纖維化肺組織AEC中PTEN基因表達(dá)降低，NF-κB活化和衰老標(biāo)記增加。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，衰老標(biāo)志物與SASP表達(dá)水平增加，NF-κB被激活，PTEN顯著降低，上調(diào)PTEN基因的表達(dá)可延長小鼠的壽命，其下調(diào)可加速小鼠衰老?；谏鲜鼋Y(jié)果，作者認(rèn)為，PTEN /NF-κB途徑控制AEC衰老，PTEN /NF-κB途徑失調(diào)可能是AEC衰老參與肺纖維化發(fā)生的機(jī)制之一。PTEN負(fù)調(diào)控的蛋白激酶B (Protein Kinase B, PKB/AKT)信號通路對細(xì)胞生長和細(xì)胞存活的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。Qiu等[30]在動物模型中發(fā)現(xiàn)PTEN的下調(diào)激活了AKT通路導(dǎo)致小鼠AEC衰老，而抑制AKT的活性可顯著減輕小鼠體內(nèi)AEC的衰老和肺纖維化程度。該結(jié)果表明，由PTEN / Akt途徑調(diào)節(jié)的衰老AEC可能促進(jìn)了肺纖維化的發(fā)生。

2.3線粒體功能障礙參與IPF的發(fā)生Zank等[31]人發(fā)現(xiàn)線粒體產(chǎn)能過程受過氧化物酶體增殖物激活的受體-γ復(fù)合物1α/β(PPARγcoactivator-1α/β，PGC-1α/β)控制。研究發(fā)現(xiàn)IPF患者和纖維化小鼠肺中PGC-1α表達(dá)均降低且缺乏PGC-1α的小鼠更易受博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的影響。此外，一磷酸腺苷活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase ，AMPK)是PGC-1α/β的上游激活物，隨年齡的增長AMPK以及線粒體功能調(diào)節(jié)因子活性受抑制，引起線粒體生物發(fā)生能力降低。這些結(jié)果均說明線粒體功能障礙可能是機(jī)體患IPF的因素之一。同時，Schuliga等[32]人通過熒光染色發(fā)現(xiàn)在IPF患者肺成纖維細(xì)胞中存在線粒體超氧化物、細(xì)胞ROS、線粒體DNA、應(yīng)激水平均升高等線粒體功能障礙表現(xiàn)，該研究結(jié)果顯示線粒體功能障礙與IPF發(fā)生確有相關(guān)性。

PTEN誘導(dǎo)的激酶1(PTEN induces putative kinase 1，PINK1)在維持線粒體的形態(tài)和功能發(fā)揮重要作用。Marta等[33]人將PINK1缺失小鼠與WT小鼠進(jìn)行圖像和形態(tài)比較發(fā)現(xiàn)PINK1缺失小鼠出現(xiàn)線粒體腫大、線粒體異常百分比增加、線粒體數(shù)量減少等現(xiàn)象且小鼠氣道周圍膠原沉積增加。在進(jìn)行氣管內(nèi)滴注博來霉素建立肺纖維化模型時發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，PINK1 缺失小鼠膠原蛋白沉積度、肺纖維化程度、TGFβ的轉(zhuǎn)錄水平均更高。由此可知，線粒體功能障礙會影響IPF的發(fā)展。

2.4輻射參與IPF的發(fā)生IR會損傷接受胸腔放射治療肺癌患者的II型肺泡上皮細(xì)胞(Type II alveolar epithelial cells，AECII)，隨著輻射持續(xù)存在，AECII損傷耗竭，再生能力下降引發(fā)細(xì)胞衰老，當(dāng)輻射再次發(fā)生時易導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。Chen等[34]將小鼠肺組織暴露于可誘導(dǎo)纖維化劑量的輻射后發(fā)現(xiàn)，衰老的AECII刺激促炎細(xì)胞因子釋放，其將巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞募集到損傷部位產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、趨化因子，放大炎癥反應(yīng)并觸發(fā)成纖維細(xì)胞的增殖和募集，一旦成纖維細(xì)胞被激活，就會轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而分泌細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)蛋白。當(dāng)輻射持續(xù)存在時，ECM產(chǎn)生過量，受損組織不斷重塑，輻射誘發(fā)的肺纖維化就會發(fā)生。

2.5其他因素參與IPF的發(fā)生

2.5.1 IL-18參與IPF的發(fā)生以往研究發(fā)現(xiàn)，在BLM誘導(dǎo)小鼠IPF模型中，IL-18表達(dá)升高，加入IL-18結(jié)合蛋白(Interleukin 18 Binding Protein，IL-18BP)后，小鼠肺中膠原蛋白沉積量、TGF-β1含量、α-SMA含量均降低，小鼠肺纖維化程度減輕且存活率提高[35]。該結(jié)果提示IL-18參與IPF的發(fā)生。同時，其他研究人員在肺纖維化小鼠體中分別分離了接受和未接受IL-18BP治療的小鼠原代肺成纖維細(xì)胞。結(jié)果顯示，未接受IL-18BP治療的小鼠肺成纖維細(xì)胞中SA-β-gal陽性細(xì)胞、P21及P53的含量均增加，而經(jīng)IL-18BP處理后含量均明顯減少。研究結(jié)果表明，IL-18BP通過結(jié)合IL-18因子阻礙小鼠肺成纖維細(xì)胞的衰老和肺纖維化的發(fā)生[36]。

2.5.2纖溶酶原激活劑抑制劑-1(plasminogen activator Inhibitor-1，PAI-1參與IPF的發(fā)生研究發(fā)現(xiàn)，AECII衰老與IPF的發(fā)生相關(guān)，在IPF中AECII內(nèi)PAI-1表達(dá)出更高的水平[37]。Jiang等[38]向PAI-1特異性敲除小鼠和WT小鼠注射BLM建立小鼠肺纖維化模型。研究發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，敲除小鼠體重、膠原蛋白、羥脯氨酸、原膠原1α1/2、α-SMA的表達(dá)均降低，小鼠肺纖維化程度減弱。該研究揭示，PAI-1的缺失保護(hù)小鼠免于博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化影響，PAI-1可能是IPF發(fā)生的相關(guān)機(jī)制之一。

2.5.3MicroRNA(miRNA)參與IPF的發(fā)生MiRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA分子,能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。有報道稱miRNA在細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及IPF發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[39]。Cui等[40]發(fā)現(xiàn)20月大老齡和10周大幼齡miR-34a消融小鼠對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化反應(yīng)不同。與老齡WT小鼠相比，老齡miR-34a消融小鼠肺纖維化程度、肺中膠原蛋白、α-SMA、纖連蛋白含量與WT小鼠相比均降低。此外，他們還發(fā)現(xiàn)纖維化小鼠肺泡上皮miR-34a的水平在老齡小鼠中上升，并在老齡小鼠的纖維化肺中被進(jìn)一步誘導(dǎo)增加。然而在幼齡小鼠中發(fā)現(xiàn)，幼齡miR-34a消融小鼠與WT小鼠相比出現(xiàn)更嚴(yán)重的纖維化。這些結(jié)果表明miRNA參與IPF的發(fā)生，且miR-34a消融對幼年和老年小鼠肺纖維化的影響不同。作者推測miR-34a可能與那些公認(rèn)參與腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)因子一樣，在生命早期對肺部起保護(hù)性作用，隨著年齡的增長對肺部起有害性作用。同時，最新研究發(fā)現(xiàn)miRNA家族其他成員也參與了IPF的發(fā)生[41-42]。

2.5.4WNT信號失調(diào)與IPF發(fā)展相關(guān)WNT信號通路具有刺激細(xì)胞生長和分化的功能，該通路的異常激活可能引起細(xì)胞的異常增殖，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[43]。在此前研究已發(fā)現(xiàn)IPF發(fā)病機(jī)制中存在WNT/β-catenin信號異常激活現(xiàn)象[44-45]。Shi等[46]在IPF患者肺組織中通過RNA序列分析顯示，WNT/β-catenin信號通路被激活且TGF-β含量增加，該信號與TGF-β之間的信號交叉對IPF的發(fā)展至關(guān)重要，阻斷WNT/β-catenin通路可引起IPF小鼠肌成纖維細(xì)胞、EMT含量降低，小鼠纖維化程度減弱。該研究結(jié)果顯示W(wǎng)NT/β-catenin信號異常激活與IPF發(fā)生相關(guān)。

WNT發(fā)育通路在胚胎發(fā)育中所必須，若在生命后期活躍起來，可能會導(dǎo)致包括肺在內(nèi)的多個器官發(fā)生病變，這一過程稱為拮抗多效性或發(fā)育漂移。這些多效性效應(yīng)也可解釋W(xué)NT/β-catenin信號異常激活在IPF發(fā)生中的作用[47]。

3 結(jié) 語

細(xì)胞衰老指的是細(xì)胞增殖能力達(dá)到極限，細(xì)胞周期進(jìn)入阻滯。最近研究發(fā)現(xiàn)衰老可能是參與IPF發(fā)生的重要因素。衰老的細(xì)胞通過誘導(dǎo)DNA損傷或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，激活DDR反應(yīng)，分泌多種促炎細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和金屬蛋白酶，以旁分泌和自分泌的方式參與IPF的發(fā)生。端粒縮短、抑癌基因的失調(diào)、線粒體功能障礙以及輻射是此前被大家所熟知的通過細(xì)胞衰老參與IPF的發(fā)生發(fā)展的途徑，近期研究發(fā)現(xiàn)PAI-1、MicroRNA、WNT信號也可通過衰老細(xì)胞導(dǎo)致IPF。這些機(jī)制為我們從發(fā)生途徑上治療IPF提供了可能和依據(jù)。然而，仍有其他因素可通過細(xì)胞衰老參與IPF的發(fā)生，其具體發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探究。