劉揚，石鳳翎，王桂花*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

隨著天然色素在食品、藥品和化妝品等領域的廣泛應用，新的天然色素的開發(fā)和應用已成為必然趨勢[1]。真菌色素作為一類天然色素，具有安全可靠、色澤自然，并兼顧營養(yǎng)和保健作用而倍受人們的喜愛[2]。內(nèi)生菌是存活于活體植物中的一類特殊微生物，在植物中廣泛存在[3]，由于內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性分泌物[4]，因此藥用植物的內(nèi)生菌具有廣闊的研究前景和藥用價值[5]。卷邊樁菇[Paxillus involutus（Batsch Fr）]屬擔子菌，生長在東北、華北、西南等地區(qū)，生長力旺盛，可在多品種樹下生長，常用于風寒濕痹、腰腿疼痛、手足麻木，具有良好的開發(fā)利用價值[6]。卷邊樁菇的提取物還具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和保護神經(jīng)細胞等功效，可用于制備藥物[7]。

張妍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，卷邊樁菇菌絲分離較適宜的培養(yǎng)基配方，并且菌蓋與菌柄連接處為分離的最佳部位，并對分離株rDNA ITS片段進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，鑒定出分離的菌株為卷邊樁菇的純菌種。謝永生等[9]研究發(fā)現(xiàn)，懷地黃內(nèi)生真菌HR-1產(chǎn)生的紅色素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉均有不同程度的抑制效果，對大腸桿菌的抑制效果與硫酸鏈霉素的抑制效果相當，抑菌率達95.7%。

近年來研究者多以真菌產(chǎn)色素作為研究對象，從而探討真菌色素的提取及優(yōu)化方法[10-11]，對于植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的天然色素成分組成研究甚少。因此本試驗通過形態(tài)學特征及基因序列分析對一株產(chǎn)紅色素卷邊樁菇內(nèi)生真菌進行菌種鑒定，將分離的菌體純化培養(yǎng)后，對其脂肪酸組成進行分析，進一步探究內(nèi)生真菌與常見色素的差別，為產(chǎn)色素資源的開發(fā)和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

采用常規(guī)內(nèi)生菌分離方法，從新鮮野生卷邊樁菇菌蓋與菌桿交界處分離得到在PDA培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生紅色素的內(nèi)生真菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，煮沸15 min后過濾，加蒸餾水至1 000 mL，葡萄糖20 g、瓊脂20 g、鏈霉素100 mg/L，pH值為自然狀態(tài)。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，煮沸15 min后過濾，加蒸餾水至1 000 mL，葡萄糖20 g，鏈霉素100 mg/L，pH值為自然狀態(tài)。

1.1.3 試劑

葡萄糖、瓊脂：中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司；GoldviewTM DNA染料、Taq酶、dDNTP：TaKaRa公司。

1.1.4 儀器與設備

BX51-P光學顯微鏡：OLYMPUS公司；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；TanonGis—2008凝膠成像系統(tǒng)：天能科技有限公司；HYG-C多功能恒溫搖床：上海一恒有限公司；HWS型智能恒溫恒濕箱：寧波東南儀器有限公司；Agilent-6890氣相色譜儀：AGILENT公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)色素內(nèi)生真菌卷邊樁菇的分離與培養(yǎng)

采新鮮卷邊樁菇，蒸餾水去除表面泥土，75%的酒精進行表面消毒，在無菌超凈臺中用無菌刀片取菌蓋與菌桿交界處組織，切成1 cm左右，接種在PDA培養(yǎng)基上，于21℃培養(yǎng)3 d～5 d，待菌落均勻鋪滿平板，分離純化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的分子生物學鑒定

接種針取適量菌體于液氮中研磨，待菌體研磨呈粉末狀后，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取總DNA，以引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-），ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-）為上下游引物PCR擴增其序列。擴增體系為：20 μL總反應體系中包括DNA模板 0.5 μL，引物 1 μL，2×MKS 10 μL，雙蒸水 8.5 μL。擴增條件：95℃預變性5 min后，進行32個循環(huán)的擴增（94℃ 1 min，48℃40 s，72℃2 min），最后 72℃充分延伸10 min，4℃保存。反應結束后，取5 μL反應產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。將PCR產(chǎn)物送至華大基因公司測序，測序結果提交Gene Bank并進行BLAST比對分析，并進行同源性比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類學地位。

1.2.3 產(chǎn)色素發(fā)酵條件的優(yōu)化

由于組織塊在普通PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，因此分別添加了經(jīng)消毒滅菌后的腐殖質(zhì)、楊樹葉，每500 mL發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中加入10 g，其余培養(yǎng)條件均相同，每組設置3個生物學重復，發(fā)酵培養(yǎng)3 d～5 d，以此來觀察菌絲的生長狀態(tài)。

1.2.4 色素的提取及鑒定

1.2.4.1 色素提取

將發(fā)酵液過濾，并用蒸餾水沖洗菌體，將菌體沖洗液與發(fā)酵過濾液合并后待用。按照體積比1∶1加入乙酸乙酯除去脂溶性雜質(zhì)，將色素液濃縮至30 mL～50 mL，真空抽濾，制備色素粗提物。

1.2.4.2 色素的鑒定

稱取250 mg凍干菌體，用液氮充分研磨，菌體粉末加入至50 mL離心管中，立即加入4 mL三氯甲烷和4 mL甲醇溶液并密封管口。搖勻后，超聲5 min，4 500 r/min離心5 min，吸取三氯甲烷萃取液，得到粗脂質(zhì)提取液。余留的殘渣按上述方法重新提取兩次，氮氣吹干稱重，計算粗脂質(zhì)占菌體干重的比例。

采用三氟化硼甲酯化方法制備脂肪酸甲酯。取0.05 g油樣于10 mL試管中，加入2 mL氫氧化鈉-甲醇溶液，65℃下皂化30 min，冷卻后加入2 mL三氟化硼/甲醇溶液（1∶3，體積比），70 ℃下皂化 3 min～5 min。使用色譜純正己烷萃取脂肪酸甲酯，并用無水硫酸鈉去除痕量水分，離心（10 000 r/min，5 min），用有機系微孔濾膜過濾后，進樣。

氣相色譜法，色譜條件：毛細管柱（CP Sil-88，60 m×250 μm×0.25 μm）。程序升溫：60 ℃保持 3 min，以5℃/min升溫至175℃，保持15min，以2℃/min升溫至220℃，保持20 min；采用火焰離子化檢測器，檢測器溫度250℃；進樣口溫度250℃；空氣壓力50 kPa；H2壓力 60 kPa；載氣 N2，壓力 240 kPa；進樣體積為 1 μL。分流比：1∶100。以歸一化方法計算各脂肪酸百分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件，Excel繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)及分子生物學鑒定結果

將斜面菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌絲生長接近培養(yǎng)皿邊緣1 cm左右時可見菌體呈現(xiàn)紅色，菌絲光滑，菌體呈現(xiàn)蔓延式點狀生長，均勻的爬滿培養(yǎng)基整個表面，有些菌落邊緣呈現(xiàn)半透明狀，真菌培養(yǎng)形態(tài)見圖1。

圖1 真菌培養(yǎng)形態(tài)Fig.1 Morphology of fungus culture

2.2 菌株的分子生物學鑒定結果

PCR擴增其序列長為574 bp，提交Gene Bank進行比對并構建進化樹，見圖2。

圖2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of fungi

由圖2可知，該序列與Fusarium petersiae（NR_156397.2）的序列同源性達到98.69%，綜合其形態(tài)學特征與測序比對結果，此內(nèi)生真菌鑒定為鐮刀菌（Fusarium petersiae）。

2.3 色素發(fā)酵條件篩選結果

不同培養(yǎng)環(huán)境下菌體生長速度見表1。

表1 不同培養(yǎng)環(huán)境下菌體生長速度Table 1 Fungal growth rate under different culture environments

不同培養(yǎng)條件對內(nèi)生真菌產(chǎn)紅色素周期影響較大，使用同一環(huán)境下的腐殖質(zhì)、楊樹葉進行培養(yǎng)時，其產(chǎn)生紅色素的量較使用普通培養(yǎng)基明顯增多，說明此內(nèi)生真菌在生長環(huán)境相似的條件下菌體生長迅速，產(chǎn)生紅色素的能力強。

2.4 色素脂肪含量的測定及成分分析

抽濾后的菌體進行稱重，重復3次，脂肪含量分別為 0.075、0.080 8、0.080 8 g，其提取率分別為（30.00%、32.32%、32.32%）。采用三氟化硼甲酯化方法制備脂肪酸甲酯，其標準品氣相色譜結果如圖3 A所示，菌體的氣相色譜結果如圖3B。采用歸一法計算各脂肪酸百分含量，結果如表2。

由圖3和表2可知，檢測到的真菌色素集中出現(xiàn)在15 min～26 min時間段內(nèi)，根據(jù)色素脂肪酸組分進行了初步鑒別，主要包含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酯、亞麻酸。且油酸和亞油酯的含量最多，分別為36.86%、27.84%。

圖3 各樣本的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of each sample

表2 樣品中脂肪酸成分氣相色譜鑒定結果Table 2 Gas chromatography identification results of fatty acid components in samples

3 結論與討論

卷邊樁菇是一種具有祛風散寒，舒筋活絡功效的植物，其多糖提取物可用于制備免疫調(diào)節(jié)的藥物[12]。而內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主植株相同或者相似的活性產(chǎn)物[13]，因此藥用植物內(nèi)生菌的研究在多個領域均具備研究價值[14-15]。目前的研究發(fā)現(xiàn)藥用植物產(chǎn)生的色素具有一定的營養(yǎng)和保健作用[16-17]，但有關卷邊樁菇內(nèi)生真菌產(chǎn)紅色素能力的研究目前未見相關報道。本試驗從卷邊樁菇中分離得到一株能產(chǎn)生紅色素的內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定此內(nèi)生菌為鐮刀菌（Fusarium petersiae）。動物體內(nèi)不能直接合成部分不飽和脂肪酸，必須從食物中獲取，而微生物中也含有不飽和脂肪酸[18]，因此本試驗對真菌色素的脂肪酸成分進行了分析，為產(chǎn)色素資源的開發(fā)和研究奠定了基礎。

鄭青波等[19]研究發(fā)現(xiàn)，艾草分離篩選得到的內(nèi)生真菌，具有多種生理活性和營養(yǎng)價值，在優(yōu)化了內(nèi)生真菌發(fā)酵條件后，紅色素產(chǎn)量得到顯著性提高。證明了不同培養(yǎng)條件對內(nèi)生真菌產(chǎn)紅色素周期影響較大，本試驗發(fā)現(xiàn)使用同一環(huán)境下的腐殖質(zhì)、楊樹葉進行培養(yǎng)時，其產(chǎn)生紅色素的量較使用普通培養(yǎng)基明顯增多，表明內(nèi)生真菌在生長環(huán)境相似的條件下菌體生長更加迅速，產(chǎn)生紅色素的能力更強。

李長皓等[20]研究發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸中的共軛亞油酸具有預防動脈粥樣硬化、腫瘤生成，改善超高胰島素血癥及調(diào)節(jié)免疫活性等作用。而油酸有順反異構體，天然油酸都是順式結構，反式結構人體不能直接吸收，但人體自身合成的油酸不能滿足需要，要從食物中攝取。本試驗發(fā)現(xiàn)真菌色素的脂肪酸組分主要包含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酯和亞麻酸。且油酸和亞油酯的含量最多，表明內(nèi)生真菌色素可能也具有軟化血管，調(diào)節(jié)新陳代謝等作用，但其功能及應用還需進一步的研究。