蔣彩云，楊仝新，張夢雨，邵夢佳，吳宜蓉

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 a.健康學(xué)院；b.江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 南京 211168)

1 概述

近年來，國內(nèi)外越來越重視中藥材的質(zhì)量安全問題。我國是中藥材種植大國，中藥原材料的儲存、運(yùn)輸和加工過程的規(guī)范性日益受到重視。在這些過程中，溫度和濕度的改變很容易滋長中藥中的真菌毒素，從而影響中藥材的質(zhì)量和療效，甚至影響服藥者的身體健康。真菌是一種真核生物，作為含毒性次級代謝產(chǎn)物，通常通過種子和孢子傳播進(jìn)行繁衍活動。真菌毒素在自然環(huán)境中大量存在，可依靠土壤、水等介質(zhì)進(jìn)行傳播。昆蟲也可攜帶毒素進(jìn)行傳播和污染。在生存條件適合的情況下，真菌將進(jìn)行大量繁殖。中藥材易受真菌毒素污染，中藥材中常見的真菌毒素是黃曲霉毒素(AF)、赭曲霉毒素A(OTA)、伏馬毒素、F-2毒素[1]。因此，加強(qiáng)中藥材中的真菌毒素檢測是十分必要的。本文對中藥材中真菌毒素的常規(guī)及快速檢測方法進(jìn)行了綜述，以期為有效監(jiān)管中藥質(zhì)量安全、減少真菌毒素侵染提供參考。

2 中藥真菌毒素檢測方法

2.1 常規(guī)檢測方法

2.1.1 薄層色譜法

薄層色譜法(TLC)是一種簡單、方便、應(yīng)用較為廣泛的定性分析方法。利用待檢測物質(zhì)對吸附劑的吸附能力與樣品中所含的其他物質(zhì)不同的特點，當(dāng)檢測所用的展開劑流過固定相時，不同成分產(chǎn)生連續(xù)性的吸附-解吸附過程，最終分離，停留在不同位置。此分析方法操作簡單，設(shè)備價格低，只需對樣品進(jìn)行簡單的處理，適用于目標(biāo)物質(zhì)的快速檢出。目前，中藥真菌毒素檢測使用較多的是常規(guī)薄層色譜法，在中藥真菌毒素定性分析、半定量分析及輔助定量分析中發(fā)揮著極其重要的作用[2]。

盧志雁等[3]采用TLC法對7種中藥材中的AF污染情況進(jìn)行測定和分析。先采用氯仿提取法對粉碎之后的神曲、麥芽、杭菊等進(jìn)行提取，再使用去油提取法對余下的四種樣品進(jìn)行去油脂提取，靜置之前加入無水Na2SO4，1 h后定容至1 mL，使用TLC法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，神曲、越鞠保和丸含有較高的AF。該方法展開時間較長，長達(dá)200 min，前期樣品處理、回流提取平均耗時13個小時，時間效率過低，靈敏度較低。檢測結(jié)果可能會因為中藥材中存在的各種物質(zhì)，以及標(biāo)準(zhǔn)品和實際樣品中所含的毒素不同而產(chǎn)生偏差。因此，該方法的應(yīng)用具有局限性，多用于定性分析及輔助定量分析，可配合超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS)進(jìn)行中藥材中真菌毒素的檢測及定量定性分析。

2.1.2 氣相色譜法

氣相色譜法(GC)是目前廣泛使用的色譜分析技術(shù)，具有靈敏度高、分離效果好、穩(wěn)定性高等優(yōu)勢。邱延濤等[4]使用氣相色譜配合具有高靈敏度的電子捕獲檢測器，對一批從市場上采購來的中藥材進(jìn)行脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的測定。首先使用重蒸水對粉碎后的樣品進(jìn)行溶解，然后用均質(zhì)器對溶解后的樣品進(jìn)行提取，取第二次濾液于錐形瓶內(nèi)，優(yōu)化柱子條件，選用免疫親和柱進(jìn)行慢速凈化操作處理，衍生之后檢測，DON的最低檢出限為2 pg，相關(guān)系數(shù)為0.9999，回收率為85.5%～97.2%，并以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)進(jìn)行結(jié)果驗證。常規(guī)GC法檢測過程較長，且需專業(yè)人員進(jìn)行操作，否則結(jié)果容易出現(xiàn)偏差，甚至對儀器造成損壞，因此應(yīng)用時具有一定局限性。

2.1.3 液相色譜法

2.1.3.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)是目前用于物質(zhì)定性定量的常用方法之一，具有檢測速度快、效率高、選擇性和重復(fù)性好、操作自動化、回收率較高等特點，加快了目標(biāo)待檢物的檢測速度，減少了中藥材成分多、基質(zhì)復(fù)雜的干擾，能夠滿足中藥材中多種真菌毒素的檢測要求。

劉麗娜等[5]使用HPLC法測定蟲草發(fā)酵粉中AF殘留量，使用液相色譜配合熒光檢測器對蟲草發(fā)酵原料藥進(jìn)行檢測。該方法效率高、準(zhǔn)確性好、操作簡便，適用于中藥材中原料藥的真菌毒素的定性定量分析研究。使用70%有機(jī)溶劑甲醇對樣品粉末進(jìn)行簡單溶解提取，先用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾操作，再經(jīng)免疫親和柱進(jìn)行凈化，以甲醇作為洗脫液，將洗脫液濃縮至0.7 mL，用純水定容至1 mL。利用此法進(jìn)行檢測，相關(guān)系數(shù)大于0.9998，回收率為80%～93%。使用LC-MS/MS進(jìn)行結(jié)果驗證，該方法結(jié)果準(zhǔn)確，可作為原料藥的AF篩查方法，科學(xué)有效地控制原料藥的質(zhì)量。劉寧等[6]使用此法測定參苓白術(shù)散中AFG2、AFG1、AFB2、AFB1，并使用MS法驗證檢測結(jié)果，結(jié)果證實此法簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于上述中藥材中多種AF的同時檢測。

2.1.3.2 超高效液相色譜法

超高效液相色譜(UPLC)的色譜柱填料粒徑比HPLC小3 μm左右，使得色譜柱的內(nèi)結(jié)構(gòu)在單位長度內(nèi)增加了理論塔板數(shù)，分離程度得到很大提高；UPLC采用超高靈敏度的檢測器和超高壓輸液泵，使得UPLC的檢測靈敏度更高，分析結(jié)果更準(zhǔn)確，UPLC的色譜峰容量也大大提高。采用UPLC法，藥品檢測分析人員能夠在更短的時間內(nèi)，以更高的色譜分離度對復(fù)雜物質(zhì)進(jìn)行分離[7]。目前，越來越多的藥學(xué)研究者使用UPLC技術(shù)檢測藥品中的復(fù)雜成分。

曹紀(jì)亮[8]使用UPLC法對生姜中痕量OTA進(jìn)行檢測。采用乙腈-水溶液對樣品中的待測物質(zhì)進(jìn)行提取，使用分子印跡固相萃取柱進(jìn)行純化操作，最后采用UPLC配合選擇性較好的FLD對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測，并使用MS法進(jìn)行結(jié)果確證，依據(jù)檢測結(jié)果可得該方法回收率高于80%。此法簡便快捷，可以科學(xué)檢測生姜中的OTA。

邢言言等[9]使用UPLC法測定了陳皮中的4種AF，先使用甲醇PBS緩沖液提取，再使用免疫磁珠富集凈化，最后使用UPLC-FLD法進(jìn)行檢測，分析檢測結(jié)果得出四種AF的色譜峰面積與其對應(yīng)的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，平均回收率大于63.9%，相關(guān)系數(shù)良好。該方法具有樣品預(yù)處理簡單、檢測速度快、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點[10]，為陳皮中AF的檢測建立了一種靈敏度高、準(zhǔn)確性高、無需衍生化的方法。

2.1.4 液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

2.1.4.1 液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)將HPLC和MS的優(yōu)勢相結(jié)合。該技術(shù)不僅具備HPLC的高分離優(yōu)勢，還充分利用質(zhì)譜儀的高選擇性、高靈敏性，大幅度提高了中藥中真菌毒素含量測定的準(zhǔn)確性，已成為真菌毒素污染檢測的核心方法。

鄭潤生[11]建立一種使用HPLC-MS法測定中藥中6種真菌毒素的檢測方法，用于檢測AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA及雜色曲霉毒素的污染情況。將中藥材苦杏仁和太子參作為樣品，采用84%乙腈作為提取劑，使用甲醇稀釋4倍，并優(yōu)化色譜流動相和洗脫梯度、重新設(shè)定質(zhì)譜參數(shù)后進(jìn)樣檢測，結(jié)果表明相關(guān)系數(shù)良好(R>0.995)，不需凈化操作就能準(zhǔn)確測定真菌毒素的污染情況。該方法具有準(zhǔn)確度高、靈敏性高等優(yōu)點。

2.1.4.2 超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

UPLC與MS聯(lián)用技術(shù)可以保留MS的優(yōu)勢。同時，UPLC獨(dú)特的高靈敏度使得中藥中真菌毒素的檢測過程更高效、結(jié)果更準(zhǔn)確。

李寧俠等[12]使用UPLC-MS法同時分析中藥酒劑中F-2毒素、伏馬菌素等多種真菌毒素的污染水平，回收率大于79.9%，相關(guān)系數(shù)R=0.9992。該方法操作步驟簡單，所得結(jié)果準(zhǔn)確性好、檢測儀器靈敏性高、分離速率快，為中藥材中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)有效的參考。

陳重均[13]將黃芪作為研究對象，對其所含有的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、T-2毒素等13種毒素進(jìn)行檢測。將10 mL乙腈加入黃芪粉末中，經(jīng)30 min超聲波震蕩混勻；離心機(jī)設(shè)置12000 r/min的速度對樣品進(jìn)行離心，保留上清液；使用氮吹儀在固定溫度、固定氮吹速率下進(jìn)行氮吹，吹至約剩1 mL樣品，再加入500 μL乙腈和25 mL純水進(jìn)行溶解、稀釋，經(jīng)HLB柱進(jìn)行凈化、洗脫操作后，在相同條件下重復(fù)氮吹；用濃度為15%的乙腈溶液將樣品定容至1 mL，超聲波震蕩混勻之后使用孔徑為0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜進(jìn)行進(jìn)樣前最后一步過濾操作；使用UPLC-MS/MS法進(jìn)行檢測，分析色譜圖可得，所測的真菌毒素色譜峰面積與其對應(yīng)的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，該方法回收率高于84.1%。UPLC-MS技術(shù)離子化效率高、分離度高、重現(xiàn)性高、適用于分離中藥材這種基質(zhì)復(fù)雜的物質(zhì)，因此常被用作中藥中真菌毒素的檢測及確證法。

2.2 快速檢測方法

從中藥原材料的生長、采收到中藥材加工再到投入臨床使用的每一個過程都有可能會遭到真菌毒素的侵染，而且中藥品種繁雜，生長產(chǎn)地、加工產(chǎn)地、出廠批次的不同都可能使得同一種中藥材含有的次生代謝產(chǎn)物不同，差異多達(dá)數(shù)十甚至數(shù)百種。想要對市場上的中藥點抽取大批量樣品進(jìn)行快速、可靠篩查，必須建立科學(xué)且切實可行的真菌毒素快速檢測方法。本文對市場上使用較為廣泛的四種方法進(jìn)行介紹。

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是專門針對大批量樣品中AFB1含量的快速檢測法，具備檢測速度快、檢測方法簡便、市場化等特點。

李汶等[14]用ELISA試劑盒檢測六神曲、淡豆豉等中藥材和中成藥中的AFB1，使用70%甲醇PBS緩沖液提取制備樣品，制作每毫升含標(biāo)準(zhǔn)毒素0.02～0.04 ng的標(biāo)準(zhǔn)品，將以上樣品及標(biāo)準(zhǔn)品放入已提前處理好的試劑盒中，進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，最后使用酶聯(lián)免疫檢測儀進(jìn)行檢測，與空白對照孔及陰性對照孔做比較。結(jié)果表明，所測樣品均受AFB1不同程度的污染。實驗結(jié)果證明該方法靈敏度良好。李延生等[15]同樣使用該方法測量一批中藥材及中成藥受AFB1的污染程度，檢測限達(dá)0.01 ng，所測樣品受AFB1污染程度也較高。該方法操作簡便，檢測所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確率高。

2.2.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法(GICA)是一種結(jié)合膠體金顯色特性和層析技術(shù)的固相膜免疫分析方法[16]。該方法以膠體金的物理性狀(如顏色反應(yīng))為顯色工具，將免疫學(xué)中抗原抗體細(xì)胞特異性結(jié)合這一特點與常規(guī)層析法相結(jié)合，從而完成對目標(biāo)物的檢測實驗。

謝艷君[17]利用檸檬酸三鈉的還原性質(zhì)制備膠體金溶液，制成膠體金快速檢測試紙條，對試紙條的特異性及靈敏性進(jìn)行考察后，向天麻、茯苓、白及、白芷4種中藥材空白基質(zhì)10 g精密加入1、5、10 μg/kg AFB1溶液，滴在試紙條上，等待10 min后，觀察結(jié)果。試紙有效的前提是C線顯色，若T線顯紅色，表明所測樣品為陰性，反之為陽性樣品。結(jié)果測得回收率為85.78%～96.65%。該實驗所制試紙條對樣品提取液中AFB1的檢測限最高為5 μg/kg，最低為1.25 μg/kg，符合AFB1限量標(biāo)準(zhǔn)的要求。該方法只需30 min就能完成檢測，實驗效率極高。李細(xì)芬等[18]在不含有AFB1的決明子、酸棗仁等6種中藥材粉末中加入定量AF對照液，同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，應(yīng)用膠體金方法檢測酸棗仁、蓮子、薏苡仁等6種中藥材中的AFB1，檢測結(jié)果與HPLC法一致。

該方法操作簡單，不需要對操作人員進(jìn)行特殊培訓(xùn)，穩(wěn)定性好，靈敏性高，10～15 min就能獲得檢測結(jié)果，重復(fù)性好，生產(chǎn)和檢測成本較低，無需任何儀器設(shè)備，適用于基層大批樣品中目標(biāo)物的快速檢測，發(fā)展前景非常可觀，在未來可能會發(fā)展為篩查中藥真菌毒素污染的最好方法。但因中藥材成分十分復(fù)雜，檢測過程中，基質(zhì)對檢測結(jié)果影響較大，所以此方法在中藥真菌毒素檢測方面沒有得到廣泛應(yīng)用，文獻(xiàn)記載較少。選用此方法進(jìn)行檢測時應(yīng)注意，待檢測的物質(zhì)盡量避免含有與標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，如以AFB1作為標(biāo)準(zhǔn)品時，應(yīng)避免樣品中含有香豆素類理化結(jié)構(gòu)，以免檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。

2.2.3 流式微球技術(shù)

在過去的十年中，流式微球技術(shù)在食品、農(nóng)產(chǎn)品、環(huán)境等領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用。該技術(shù)具有所需樣品容量小、靈敏度高、特異性和重現(xiàn)性好、分析時間短、檢測費(fèi)用低及可以做到多種物質(zhì)同時檢測等優(yōu)勢，因此適用于現(xiàn)場目標(biāo)物的快速篩查工作。流式微球技術(shù)(CBA)是應(yīng)用流式細(xì)胞儀，使用具有獨(dú)特?zé)晒鈴?qiáng)度的編碼微球，基于小分子物質(zhì)抗原與免疫抗體之間存在的間接競爭免疫分析的原理，使得目標(biāo)物直接或間接共軛于熒光微球的檢測抗體，以完成復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的定性及定量實驗。

肖昌彬等[19]以磁光微球為載體，利用CBA技術(shù)對中藥麥芽中OTA含量進(jìn)行檢測。首先使用60%甲醇PBS溶液進(jìn)行提取，再加入濃度為20%的甲醇PBS溶液進(jìn)行稀釋操作，離心后與牛血清白蛋白-OTA(BSA-OTA)復(fù)合物在微球上進(jìn)行偶聯(lián)，將熒光素標(biāo)記加入樣品，使用離心機(jī)對其進(jìn)行離心操作后，保留下部分樣品，使用緩沖液洗滌之后，將制成的樣品放入流式細(xì)胞儀通道對OTA進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，此方法檢出限為0.12 ng/mL，平均回收率大于93.9%，相關(guān)系數(shù)良好，使用LC-MS/MS進(jìn)行確證，得出此檢測方法靈敏性好，準(zhǔn)確度高，且其小麥樣品提取操作簡單，提取效率高，為中藥麥芽中真菌毒素的檢測提供了一種快速、經(jīng)濟(jì)的檢測手段。

2.2.4 近紅外熒光傳感法

20世紀(jì)50年代，近紅外技術(shù)首先被應(yīng)用于農(nóng)副產(chǎn)品的分析中，但在當(dāng)時，該技術(shù)尚不完善，功能不健全，所以并沒有被廣泛應(yīng)用在定性分析工作中；直到約30年之后，隨著互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，近紅外技術(shù)也得到了大幅度的提升，并且成為最有效的有機(jī)物質(zhì)定量定性分析技術(shù)之一。

曾云龍等[20]采用近紅外熒光傳感法測定一批中草藥中痕量OTA的含量。以近紅外熒光碳量子點為檢測探針，該方法的特異性結(jié)合體為OTA核酸適體，建立近紅外熒光法配合核酸適體OTA形成的傳感檢測平臺。平臺建立期間，作者對傳感體系組成、酸堿度、孵化時間等影響因素進(jìn)行了一系列的研究分析，最終得出結(jié)論：OTA濃度在 0.015～1.5 ng·mL-1范圍內(nèi)檢測效果較好，檢測限為 8 pg·mL-1。在所測中藥批次中，發(fā)現(xiàn)連翹、蓮子、陳皮、甘草等均受到OTA的污染。該技術(shù)操作簡單，碳量子源豐富，成本較低，被廣泛應(yīng)用于各檢測分析領(lǐng)域。

3 總結(jié)與展望

本文將我國近年來針對中藥材中真菌毒素的檢測方法進(jìn)行了概括總結(jié)，在此過程中發(fā)現(xiàn)，我國對于中藥材中真菌毒素的檢測方法種類較多，但各有優(yōu)缺點。今后可將多種檢測方法進(jìn)行聯(lián)用，優(yōu)勢互補(bǔ)，從而使得檢測效率達(dá)到最大化。同時應(yīng)積極研究發(fā)展針對伏馬菌素、T-2毒素和F-2毒素的高效檢測方法。

我國對于食品、飼料中的真菌毒素限量都有明確的標(biāo)準(zhǔn)，但中藥材基質(zhì)復(fù)雜、結(jié)構(gòu)繁多，因此中藥材真菌毒素殘留檢測方面的標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善?？蓞⒖嘉覈称?、飼料等方面的真菌毒素檢測方法，使用有效的方法對中藥材中的真菌毒素進(jìn)行檢測研究試驗，也可參考引用國外相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)，結(jié)合中國人的身體特點等綜合因素考慮毒素限量，從而制訂標(biāo)準(zhǔn)。