復(fù)合酶協(xié)同超聲輔助提取東北土當歸葉中總黃酮及其抑菌活性的研究

吳淑清，艾叢蘋，欒茗然，朱文秀

(1.長春大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130022；2.浙江李子園食品股份有限公司，浙江 金華 321000)

東北土當歸，學(xué)名長白楤木，又稱草本刺嫩芽、狗苦龍芽等[1]，營養(yǎng)物質(zhì)極為豐富，既是山野菜，又是中草藥。古醫(yī)書記載其根可入藥，具有祛風(fēng)燥濕、解熱鎮(zhèn)痛、疏風(fēng)活血和利尿解毒等功效[2]。東北土當歸中黃酮類化合物和苷類化合物具有較強的抗氧化活性[3]，貝殼烯酸、貝殼杉醇酸、海松酸等二萜成分具有鎮(zhèn)靜作用[4]。此外，其葉中含有的某些成分具有降血壓、降血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、預(yù)防心腦血管疾病、延緩衰老和保護神經(jīng)系統(tǒng)等功效[5]。

復(fù)合酶協(xié)同超聲波提取東北土當歸葉中總黃酮的原理是，酶可破壞植物組織細胞，使細胞壁破裂，從而降低與溶劑之間的傳質(zhì)阻力[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北土當歸：由長春大學(xué)園林學(xué)院王曉紅教授的實驗種植基地提供；蘆丁標準品：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶(400 U/mg)、果膠酶(50000 U/g)：美國sigma公司；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠，均為分析純；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

供試菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，均為長春大學(xué)實驗室留存菌種。

1.2 儀器與設(shè)備

WJX-A1000型高速多功能粉碎機：上海緣沃工貿(mào)有限公司；超聲波清洗器：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；721型可見分光光度計：日本島津儀器有限公司；TDL-50B低速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 東北土當歸葉預(yù)處理

將新鮮東北土當歸葉清洗干凈，自然曬干后，置于粉碎機中粉碎，再過40目(0.425 mm)篩，裝入密封袋，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總黃酮提取工藝流程

東北土當歸葉總黃酮提取工藝流程見圖1。

圖1 東北土當歸葉總黃酮提取工藝流程

1.3.3 標準曲線的制作

將蘆丁標準品經(jīng)110 ℃干燥至恒重，冷卻至室溫備用。稱取蘆丁標準品10 mg，用30%乙醇于50 mL容量瓶中定容，超聲溶解5 min，可得濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液，冷藏保存?zhèn)溆?。分別吸取蘆丁標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL的比色管中，各加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL、10%硝酸鋁溶液1 mL、1 mol/L氫氧化鈉10 mL，最后用50%乙醇定容至刻度線，搖勻，放置10 min，于510 nm處測定吸光度[7]，繪制標準曲線。得到回歸方程：y=10.232x+0.0049(R2=0.9992)，式中，y為吸光度，x為蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)。結(jié)果表明，蘆丁標準品溶液濃度為0.01～0.05 mg/mL時，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.4 東北土當歸葉總黃酮的測定

吸取5 mL樣液于25 mL容量瓶中，其他操作按照制作標準曲線的方法處理。計算東北土當歸葉中總黃酮含量，公式如下：

式中，T：總黃酮物質(zhì)的含量，mg/g；C：總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V：總黃酮提取液體積，mL；m：樣品質(zhì)量，g；n：稀釋倍數(shù)。

1.3.5 單因素實驗和正交試驗

采用復(fù)合酶協(xié)同超聲波提取法從東北土當歸葉中提取總黃酮，以總黃酮提取量作為衡量標準，確定各因素的最適范圍。單因素實驗因素水平見表1。

表1 單因素實驗因素水平

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(34)正交試驗，以確定總黃酮的最佳提取工藝。正交試驗因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平

1.3.6 總黃酮提取液的抑菌試驗

吸取0.1 mL無菌水，將菌液稀釋為0.5個麥氏比濁度的菌懸液，再用移液槍吸取100 μL稀釋菌液滴加在平板上，用涂布棒將菌液均勻涂布在滅菌平板上。用無水乙醇將總黃酮提取液分別稀釋成不同濃度，將滅菌后的濾紙片浸泡在提取液中1 h，于紫外燈下照射20 min。用無菌鑷子夾取濾紙片，3片一組等間距放在培養(yǎng)基上。用浸有無菌水的濾紙片做對照，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出后觀察是否有透明圈[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶比例對總黃酮提取量的影響

由圖2可知，當復(fù)合酶(纖維素酶/果膠酶)比例為1∶2時，總黃酮提取量達到最大值。纖維素酶占比的增加能更好地破壞東北土當歸葉的細胞壁，使得細胞中的總黃酮物質(zhì)更好地溶出；但纖維素酶占比過高時，底物濃度不能使復(fù)合酶達到飽和狀態(tài)，復(fù)合酶的作用會受到抑制，進而導(dǎo)致總黃酮提取量降低[9]。

圖2 復(fù)合酶比例對總黃酮提取量的影響

2.1.2 料液比對總黃酮提取量的影響

由圖3可知，當料液比為1∶40(g/mL)時，總黃酮提取量達到最大值。但隨著溶劑量的增加，一方面總黃酮類物質(zhì)的溶出量有限；另一方面溶劑過多會導(dǎo)致其他雜質(zhì)的大量溶出，而有些雜質(zhì)與總黃酮類物質(zhì)之間存在拮抗作用，會影響提取效果[10]。

圖3 料液比對總黃酮提取量的影響

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

由圖4可知，當乙醇濃度為40%時，總黃酮提取量達到最大值。根據(jù)相似相溶的原理，極性越接近，溶解度越大。當乙醇濃度為40%時，溶劑的極性和黃酮的極性最為接近，黃酮溶解度最大[11]。

圖4 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

2.1.4 超聲溫度對總黃酮提取量的影響

由圖5可知，當超聲溫度為50 ℃時，總黃酮提取量達到最大值。適當升高溫度有利于總黃酮類物質(zhì)的溶出；但過高的溫度會導(dǎo)致總黃酮類物質(zhì)氧化和降解，使提取量下降[12]。

圖5 超聲溫度對總黃酮提取量的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，試驗結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果

由表3可知，影響總黃酮提取量的四個因素的主次順序為乙醇濃度>料液比>復(fù)合酶比例>超聲溫度，最佳提取工藝條件為A3B1C3D2，即復(fù)合酶比例2∶1、料液比1∶30(g/mL)、乙醇濃度50%、超聲溫度50 ℃。

2.3 驗證實驗

對正交試驗得到的最佳工藝條件進行驗證實驗。經(jīng)過三次平行實驗，實際測得總黃酮提取量為12.6 mg/g，與預(yù)測值相近，說明工藝優(yōu)化得到的技術(shù)參數(shù)是穩(wěn)定可靠的。

2.4 抑菌試驗結(jié)果

由表4可知：當稀釋濃度倍數(shù)高于1/4時，兩種細菌均有透明抑菌圈，表明總黃酮提取液對兩種細菌均有不同程度的抑制作用；當稀釋濃度倍數(shù)為1/4時，金黃色葡萄球菌周圍幾乎沒有抑菌圈，隨著總黃酮濃度的降低，抑菌圈也減小至無；當稀釋濃度倍數(shù)為1/8時，沒有抑菌效果。由以上結(jié)果可以得出，對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度為0.5 mg/mL，對大腸桿菌的抑菌濃度為0.25 mg/mL。

表4 總黃酮提取液抑菌試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本研究以東北土當歸葉為原料，以乙醇溶液為溶劑，采用復(fù)合酶(纖維素酶/果膠酶)協(xié)同超聲波提取東北土當歸葉中總黃酮。通過單因素實驗和正交試驗，確定最佳提取工藝：復(fù)合酶比例2∶1、料液比1∶30 (g/mL)、乙醇濃度50%、超聲溫度50 ℃。在此條件下，總黃酮提取量達到最大值，為12.6 mg/g。通過抑菌試驗證明東北土當歸葉總黃酮有良好的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度為0.5 mg/mL，對大腸桿菌的抑菌濃度為0.25 mg/mL。