孫 赫，馬井喜，趙大芳，陳慧真

(長(zhǎng)春大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022)

黃秋葵含有豐富的功能活性物質(zhì)，其中包括對(duì)人體有益的黏性多糖、果膠、纖維素等成分。傳統(tǒng)多糖提取方法耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，無法滿足生產(chǎn)生活需要，因此對(duì)多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化十分必要。本研究采用堿提法、水提醇沉法、超聲波提取法對(duì)黃秋葵多糖提取進(jìn)行研究，以期為黃秋葵多糖提取工藝的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

原料：黃秋葵，購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市沃爾瑪超市。

試劑：苯酚、濃硫酸、無水乙醇、鹽酸、氯仿，均為分析純，西安化學(xué)試劑廠；正丁醇、乙醚、丙酮、氨水，均為分析純，天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

全能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；分析天平：上海天平儀器有限公司；恒溫水浴鍋：上海樹立；臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)貝克曼公司；真空干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見光分光光度計(jì)：天津市泰斯特儀器有限公司；酸度計(jì)：廣州深華生物有限公司；超聲波清洗器：上海易凈超聲波儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵：天津市泰斯特儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海樹立。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取10 mg葡萄糖(分析純)，加入蒸餾水溶解，而后轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容并搖勻，配制成的葡萄糖樣液即為標(biāo)準(zhǔn)品。用微量吸取器分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8 mL標(biāo)準(zhǔn)品，在每個(gè)比色皿中加入蒸餾水，總?cè)芤簽?.0 mL，以此配比溶液梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入5%苯酚1 mL及濃硫酸5.0 mL，輕微震蕩以加速反應(yīng)，放置20 min后進(jìn)行測(cè)定?？瞻讓?duì)照組為1.0 mL蒸餾水，按同樣操作流程加入苯酚及濃硫酸。記錄所測(cè)數(shù)據(jù)，進(jìn)行線性擬合。

1.3.2 黃秋葵多糖的提取方法

1.3.2.1 主要提取方法

(1)堿提法。準(zhǔn)確稱取2.0 g黃秋葵粉末置于燒杯中，加入600 mL無水乙醇，充分混合均勻以除去部分色素；而后進(jìn)行抽濾，在濾渣中加入堿液進(jìn)行溶解浸提；取上清液離心并冷凍干燥，最后提取得到的即為黃秋葵粗多糖。

(2)水提醇沉法。準(zhǔn)確稱取2.0 g黃秋葵粉末，加入適量蒸餾水?dāng)嚢杌靹?，防止結(jié)塊沉淀；100 ℃熱水條件下浸提2次，將浸提液蒸發(fā)濃縮；在蒸發(fā)濃縮后的液體中加入無水乙醇浸提多糖，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可知最后會(huì)產(chǎn)生部分沉淀物質(zhì)，將該浸提液加速離心，得到部分固態(tài)沉淀物；將沉淀物加入少量蒸餾水進(jìn)行溶解并且再次加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，在最后一次沉淀實(shí)驗(yàn)中所得到的沉淀物即為黃秋葵粗多糖。

(3)超聲波提取法。準(zhǔn)確稱取2.0 g黃秋葵粉末，加入蒸餾水混合均勻；再用飽和Ca(OH)調(diào)節(jié)pH值，置于超聲波儀器中進(jìn)行提??；將上清液通過乙醇沉淀后再次進(jìn)行離心，放置一段時(shí)間使乙醇揮發(fā)完全，最后提取得到的即為黃秋葵粗多糖。

1.3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取2.0 g黃秋葵粉末，按照上述多糖提取工藝步驟提取粗多糖。將提取到的黃秋葵粗多糖放置于100 mL 燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓俎D(zhuǎn)移到1000 mL容量瓶中定容并搖勻。用微量吸取器分別吸取1.0 mL樣液于試管中，并且同時(shí)以1.0 mL水按同樣操作流程作為空白對(duì)照組，于 485 nm 處測(cè)定吸光值。記錄所測(cè)數(shù)據(jù)，并且考察3 h內(nèi)吸光值的穩(wěn)定性(每30 min測(cè)1次)。

1.3.2.3 多糖溶解性實(shí)驗(yàn)

取適量三種提取法制得的黃秋葵粗多糖，分別溶于熱水、冷水、乙醇、丙醇、正丁醇、氯仿等有機(jī)溶劑中，觀察其溶解性。

1.3.2.4 精密度試驗(yàn)

將三種提取法制得的黃秋葵粗多糖分別放置于燒杯中，加入蒸餾水混合均勻，分別取6份2 mL樣液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(每種提取法2份樣液)。利用苯酚-硫酸法測(cè)定樣液，通過顯色反應(yīng)測(cè)定每個(gè)時(shí)間段的吸光度。通過比較6份樣液的RSD值，可以考察三種提取方法的精密度。

1.4 黃秋葵多糖提取工藝優(yōu)化

1.4.1 超聲波法單因素實(shí)驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)溫度。稱取4.0 g黃秋葵粉末，在料液比為1∶30的情況下，加入蒸餾水混合均勻，再用飽和Ca(OH)堿液將溶液的pH值調(diào)節(jié)為9。然后將樣液平均分成4份，分別在50、60、70、80 ℃條件下提取20 min。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(2)浸提時(shí)間。稱取4.0 g黃秋葵粉末，在料液比為1∶30的情況下，加入蒸餾水混合均勻，再用飽和Ca(OH)堿液將溶液的pH值調(diào)節(jié)為9。然后將樣液平均分成4份，在相同實(shí)驗(yàn)溫度下分別浸提15、20、25、30 min。

(3)料液比。稱取4.0 g黃秋葵粉末，平均分成4份，每份1.0 g。分別按照料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入蒸餾水混合均勻，再用飽和Ca(OH)堿液將溶液的pH值調(diào)節(jié)為9，然后在60 ℃條件下提取20 min。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(4)實(shí)驗(yàn)pH值。稱取4.0 g黃秋葵粉末，在料液比為1∶30的情況下，加入蒸餾水混合均勻，然后將樣液平均分成4份，用飽和Ca(OH)堿液將溶液的pH值分別調(diào)節(jié)為7、8、9、10，并在60 ℃條件下提取20 min。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4.2 超聲波法正交試驗(yàn)

選取超聲波提取法的實(shí)驗(yàn)溫度、浸提時(shí)間、料液比、實(shí)驗(yàn)pH值為影響因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以確定超聲波法提取黃秋葵多糖的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 超聲波法正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程為y=0.222x-0.2153，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9995，可達(dá)到小數(shù)點(diǎn)后3個(gè)9，說明結(jié)果良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 堿提法結(jié)果

2.2.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

堿提法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)顯示，吸光度在3 h內(nèi)變化范圍較小，因此本實(shí)驗(yàn)利用苯酚-硫酸法進(jìn)行黃秋葵多糖的定性和定量測(cè)定是有理論及實(shí)踐依據(jù)的。

表2 堿提法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 多糖溶解性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，堿提法提取的粗多糖易溶于極性有機(jī)溶劑，在熱水、冷水中都有較好的溶解效果，但不溶于高濃度的非極性有機(jī)溶劑，如丙酮、氯仿、正丁醇、乙醚等。

2.2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

堿提法精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。根據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)的計(jì)算公式得出RSD為0.0783%，說明試驗(yàn)結(jié)果精密度較好。

表3 堿提法精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 水提醇沉法結(jié)果

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

水提醇沉法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)顯示，吸光度在3 h內(nèi)變化范圍較小，因此本實(shí)驗(yàn)利用苯酚-硫酸法進(jìn)行黃秋葵多糖的定性和定量測(cè)定是有理論及實(shí)踐依據(jù)的。

表4 水提醇沉法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 多糖溶解性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水提醇沉法提取的粗多糖易溶于極性有機(jī)溶劑，在熱水、冷水中都有較好的溶解效果，但不溶于高濃度的非極性有機(jī)溶劑，如丙酮、氯仿、正丁醇、乙醚等。

2.3.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

水提醇沉法精密度試驗(yàn)結(jié)果見表5。計(jì)算6份樣品的吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得出RSD為0.0194%，說明試驗(yàn)結(jié)果精密度較好。

表5 水提醇沉法精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 超聲波法結(jié)果

2.4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

超聲波法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表6。數(shù)據(jù)顯示，吸光度在3 h內(nèi)變化范圍較小，因此本實(shí)驗(yàn)利用苯酚-硫酸法進(jìn)行黃秋葵多糖的定性和定量測(cè)定是有理論及實(shí)踐依據(jù)的。

表6 超聲波法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 多糖溶解性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲波法提取的粗多糖易溶于極性有機(jī)溶劑，在熱水、冷水中都有較好的溶解效果，但不溶于高濃度的非極性有機(jī)溶劑，如丙酮、氯仿、正丁醇、乙醚等。

2.4.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

超聲波法精密度試驗(yàn)結(jié)果見表7。計(jì)算6份樣品的吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得出RSD為0.0074%，說明試驗(yàn)結(jié)果精密度好。

表7 超聲波法精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 超聲波法單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.5.1 實(shí)驗(yàn)溫度對(duì)多糖得率的影響

由圖2可以看出，多糖得率隨著實(shí)驗(yàn)溫度上升而提高，當(dāng)實(shí)驗(yàn)溫度為60 ℃時(shí)，多糖得率最高。

圖2 實(shí)驗(yàn)溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.5.2 浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖3可以看出，多糖得率隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。但是時(shí)間過長(zhǎng)可能造成超聲波空化作用太久，長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用可能使多糖鏈斷裂，破壞多糖結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致提取率降低。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.5.3 料液比對(duì)多糖得率的影響

由圖4可以看出，加大料液比可以在一定程度上提高多糖提取率。當(dāng)料液比較大時(shí)，溶液中的多糖濃度低，使得溶液和黃秋葵之間形成了另一個(gè)濃度差，從而加快分子的擴(kuò)散速率。同時(shí)，料液比加大可以使膠質(zhì)多糖的分解速率加快，促使多糖分子從黃秋葵中加速分離。

圖4 料液比對(duì)多糖提取率的影響

2.5.4 實(shí)驗(yàn)pH值對(duì)多糖得率的影響

由圖5可以看出，多糖得率隨著pH值增大而提高，當(dāng)pH值為9時(shí)，提取效果最佳。多糖在酸性或者堿性條件下會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，最后生成單糖，因此在pH值很低或者很高的情況下多糖均會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，并且過酸或過堿的條件也會(huì)使得黃秋葵中纖維素等物質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng)。

圖5 實(shí)驗(yàn)pH值對(duì)多糖提取率的影響

2.6 超聲波法正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

超聲波法正交試驗(yàn)結(jié)果見表8。各因素的影響程度為B>A>D>C，即浸提時(shí)間>實(shí)驗(yàn)溫度>實(shí)驗(yàn)pH值>料液比。最優(yōu)組合為A3B2C1D3，即實(shí)驗(yàn)溫度70 ℃、浸提時(shí)間20 min、料液比1∶30、實(shí)驗(yàn)pH值10，在此條件下，黃秋葵多糖得率為6.79%。

表8 超聲波法正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文以黃秋葵為原料，比較堿提法、水提醇沉法、超聲波提取法三種方法的多糖提取效果，探究黃秋葵多糖的最佳提取工藝。通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)得出，利用超聲波提取黃秋葵多糖的最佳提取工藝為實(shí)驗(yàn)溫度70 ℃、浸提時(shí)間20 min、料液比1∶30、實(shí)驗(yàn)pH值10。在此條件下，黃秋葵多糖得率達(dá)到最大值，為6.79%。