納米氧化鋅對綠草履蟲的毒性效應(yīng)研究

高希蕾,鞏志偉,譚炳鈺,倪 兵

(1.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2.華東師范大學(xué) 物理與電子科學(xué)學(xué)院，上海 200241)

納米氧化鋅(ZnO NPs)對微生物有殺滅作用，因而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥材料的制造[1-5]，然而其不當(dāng)排放會(huì)導(dǎo)致流入水體，因而會(huì)對水生環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，因此，ZnO NPs對細(xì)胞毒性的研究日益受到重視.目前對ZnO NPs毒理研究大多以哺乳動(dòng)物、魚類和溞等多細(xì)胞動(dòng)物為受試對象[6-9]，原生動(dòng)物是食物鏈底層的單細(xì)胞生命體，其對環(huán)境變化的敏感性遠(yuǎn)大于多細(xì)胞動(dòng)物，然而以原生動(dòng)物為受試對象來探究納米材料毒性的研究較少，用來研究ZnO NPs對綠草履蟲毒性的則未見報(bào)道[10-12].本實(shí)驗(yàn)首次選取綠草履蟲(Parameciumbursaria)作為受試對象來研究ZnO NPs進(jìn)入水環(huán)境之后對水生生物的毒害作用，通過測定綠草履蟲對ZnO NPs的敏感度，嘗試提供一種尺度，以衡量排入地表水中的ZnO NPs所造成的生態(tài)破壞的程度和潛力.

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所選擇的綠草履蟲(P.bursaria)從種庫取出直接接種至含有麥粒發(fā)酵液的培養(yǎng)皿中，在恒溫培養(yǎng)箱中(25℃)進(jìn)行培養(yǎng).ZnO NPs((30±10)nm)從中國麥克林生化科技有限公司購買.將ZnO NPs粉末溶于培養(yǎng)水中配制成納米溶液，超聲波解聚20min后用于表征和毒理數(shù)據(jù)的測定.

1.2 ZnO NPs對綠草履蟲24h內(nèi)半致死濃度(24h-LC50)和半最大效應(yīng)濃度(24h-EC50)的測定

挑選30只綠草履蟲分別加至0.20，0.25，0.50，1.00，2.00，2.50mg/L濃度的ZnO NPs溶液中，24h后記錄綠草履蟲的死亡個(gè)數(shù).每組設(shè)置6組平行組，對照組加入等量培養(yǎng)水.將實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸入至Origin 8中進(jìn)行分析，以上述6組ZnO NPs溶液的濃度對數(shù)值(-0.70，-0.60，-0.30，0，0.30，0.40)為自變量x，致死率(%)為因變量y，得到ZnO NPs濃度對數(shù)對綠草履蟲24h內(nèi)致死率的回歸方程及其擬合曲線.根據(jù)回歸方程計(jì)算納米氧化鋅對綠草履蟲的24h-LC50值.

挑選30只綠草履蟲分別加至0.0125，0.0250，0.0500，0.1000，0.1500，0.2000，0.2500mg/L濃度的ZnO NPs溶液中，24h后記錄綠草履蟲的繁殖個(gè)數(shù)，對照組與實(shí)驗(yàn)組的繁殖個(gè)數(shù)之差為繁殖抑制個(gè)數(shù).每組設(shè)置6組平行組，對照組加入等量培養(yǎng)水.將數(shù)據(jù)輸入至Origin 8中進(jìn)行分析，以上述7組ZnO NPs溶液的濃度對數(shù)值(-1.90，-1.60，-1.30，-1.00，-0.82，-0.70，-0.60)為自變量x，繁殖抑制率(%)為因變量y，得到ZnO NPs濃度對數(shù)對綠草履蟲24h內(nèi)繁殖抑制率的回歸方程及其擬合曲線.根據(jù)回歸方程計(jì)算納米氧化鋅對綠草履蟲的24h-EC50值.

1.3 鋅離子濃度與綠草履蟲致死率的關(guān)系

配制25，50，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000μg/L的鋅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mg/L ZnO NPs溶液，利用ICP-AES(IRIS II XSP)檢測不同濃度中ZnO NPs中鋅離子的量.結(jié)果用Origin 8軟件分析.

鋅離子對綠草履蟲的毒性測定方法同1.2.

1.4 電鏡樣品的制備

綠草履蟲經(jīng)過24h-LC50濃度的ZnO NPs溶液處理4，8，16，24h后，用四氧化鋨與升汞的混合物4℃避光固定10min，經(jīng)常規(guī)脫水、臨界點(diǎn)干燥、噴金后完成樣品的制備，掃描電子顯微鏡(S4800)觀察.透射電鏡樣品經(jīng)前固定、后固定、常規(guī)脫水包埋、超薄切片、染色后用透射電子顯微鏡(HT7700)觀察.未經(jīng)ZnO NPs溶液處理過的綠草履蟲作為對照組.

1.5 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的檢測

收集蟲液至離心管中，對照組加入300μL的培養(yǎng)水，實(shí)驗(yàn)組分別加入300μL 24h-EC50濃度的ZnO NPs溶液處理4，8，16，24h.超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)酶活力和丙二醛(MDA)含量變化的測定方法參考SOD、CAT檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒說明書.

收集蟲液至離心管中，對照組加入300μL的培養(yǎng)水，實(shí)驗(yàn)組分別加入300μL 24h-LC50和24h-EC50濃度的ZnO NPs溶液進(jìn)行4h的處理.活性氧(ROS)量的測定參考超氧化物陰離子熒光探針(Dihydro-ethidium)試劑盒說明書.在熒光顯微鏡(ZEISS Imager Z.2)下觀察熒光強(qiáng)度，結(jié)果用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度的分析.

1.6 數(shù)據(jù)計(jì)算與分析

納米氧化鋅、鋅離子對綠草履蟲的毒理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及酶活力測定結(jié)果用Origin 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、作圖和顯著性分析；平均熒光強(qiáng)度利用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行分析和計(jì)算.

2 結(jié) 果

2.1 ZnO NPs的表征

透射電鏡(TEM)下觀察到ZnO NPs顆粒近似球形，直徑為(30±10)nm，分散性較差(圖1(a))，在培養(yǎng)水中易聚集.

圖1 ZnO NPs的TEM表征結(jié)果

2.2 ZnO NPs對綠草履蟲半致死濃度(24h-LC50)和半最大效應(yīng)濃度(24h-EC50)的測定

經(jīng)Origin 8軟件分析，綠草履蟲的致死率和繁殖抑制率與ZnO NPs的濃度對數(shù)均呈線性關(guān)系，線性擬合曲線如圖2所示.其回歸方程分別為：y=0.55936x+0.73135(R2=0.97614)和y=0.42647x+1.09511(R2=0.98816).ZnO NPs對綠草履蟲的24h-LC50和24h-EC50分別為0.39mg/L和0.04mg/L.

2.3 綠草履蟲超微結(jié)構(gòu)的變化

2.3.1 綠草履蟲表面超微結(jié)構(gòu)的變化

對照組綠草履蟲在掃描電鏡(SEM)下為棒狀(圖3(a,b))，經(jīng)ZnO NPs處理后，細(xì)胞逐漸變?yōu)樗螤?圖3(c,d,e,f)).對照組綠草履蟲表面分布著大量纖毛，表膜突起形成規(guī)則的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)(圖4(a,b)).經(jīng)ZnO NPs處理后，細(xì)胞膜破損和纖毛脫落的程度隨處理時(shí)間的延長而加重，表膜突起形成的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)扭曲、皺縮甚至消失(圖4(e,f,g,h)).掃描電鏡結(jié)果表明ZnO NPs處理后,綠草履蟲表面結(jié)構(gòu)損傷明顯.

圖3 ZnO NPs處理(a,b)0h,(c)4h,(d)8h,(e)16h,(f)24h后綠草履蟲的整體變化

圖4 ZnO NPs處理(a,b)0h,(c)4h,(d)8h,(e,f)16h,(g,h)24h后綠草履蟲纖毛和表膜的損傷

2.3.2 綠草履蟲內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化

對照組綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)分布著大量小球藻和射出胞器,與綠草履蟲共生的小球藻電子密度較高，被圍藻泡包圍(圖5(a,b,c)).細(xì)胞內(nèi)可觀察到雙層膜的線粒體(圖5(d)).大核明顯，核內(nèi)分布著染色質(zhì)和染色質(zhì)粒(圖5(e)).表膜由外至內(nèi)分別為細(xì)胞膜、外表膜泡膜、內(nèi)表膜泡膜，內(nèi)外表膜泡膜組成表膜泡(圖5(f)).

圖5 綠草履蟲對照組的透射電鏡觀察結(jié)果

綠草履蟲經(jīng)0.39mg/L的ZnO NPs溶液處理4h后，細(xì)胞內(nèi)的線粒體異常聚集(圖6(a,b)).綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)的小球藻開始萎縮消解(圖6(c)).

處理綠草履蟲8h后，部分線粒體的膜結(jié)構(gòu)消失，電鏡下只可見部分散亂的線粒體嵴(圖6(d)).16h后染色質(zhì)粒開始變形(圖6(e)).表膜結(jié)構(gòu)異常，表膜泡中開始出現(xiàn)無序膜結(jié)構(gòu)(圖6(f)).

經(jīng)ZnO NPs溶液處理24h之后的綠草履蟲，細(xì)胞內(nèi)可以觀察到較多的溶酶體(圖6(g)).刺絲泡開始消解，邊緣呈彌散狀(圖6(h)).表膜泡中出現(xiàn)了大量圓形、散亂無序的膜狀結(jié)構(gòu)(圖6(i)).推測這可能是導(dǎo)致表膜破損的主要原因(圖6(j)).

圖6 ZnO NPs處理4h,8h,16h,24h后綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化

2.4 鋅離子和ZnO NPs顆粒對綠草履蟲的細(xì)胞毒性

表1 不同濃度ZnO NPs解離出Zn2+的含量

分析ZnO NPs溶液的解離度、鋅離子濃度對數(shù)與致死率的擬合曲線、ZnO NPs濃度與致死率的擬合曲線(圖7)，可知ZnO NPs顆粒本身對綠草履蟲的毒性大小并沒有隨著濃度的升高而增大.ZnO NPs濃度較低時(shí)，解離出鋅離子的量較少，鋅離子對綠草履蟲毒性貢獻(xiàn)不明顯，但隨著ZnO NPs濃度的升高，鋅離子解離出的量隨之增加，對綠草履蟲毒性貢獻(xiàn)也隨之增大，ZnO NPs所表現(xiàn)出來整體毒性的增加歸因于此.

圖7 鋅離子(a)和ZnO NPs顆粒(b)對綠草履蟲致死率的擬合曲線

2.5 ZnO NPs誘導(dǎo)綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)

對照組綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)只出現(xiàn)少量紅色熒光點(diǎn)，而EC50濃度的ZnO NPs處理綠草履蟲4h后，細(xì)胞內(nèi)紅色熒光增強(qiáng)，細(xì)胞核沒有出現(xiàn)紅色熒光.LC50濃度的ZnO NPs處理4h之后，綠草履蟲的細(xì)胞核顯出明顯的紅色熒光(圖8).對照組、EC50處理組、LC50處理組的平均熒光強(qiáng)度分別為20.04、26.59、35.3，也說明綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)ROS積累的量與ZnO NPs的處理濃度成正比.

圖8 DHE探針檢測ZnO NPs處理后綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)ROS的積累：(a)對照組；(b)EC50實(shí)驗(yàn)組；(c)LC50實(shí)驗(yàn)組

ZnO NPs處理后的綠草履蟲，細(xì)胞內(nèi)可能產(chǎn)生了過多超氧陰離子自由基，這使SOD酶活性大幅上升以降低細(xì)胞內(nèi)自由基的含量.CAT酶的活性在SOD酶被激活的同時(shí)也被激活,用以清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2.隨著處理時(shí)間的延長，SOD酶活力受到抑制，CAT的活力也隨之下降.整個(gè)處理過程中，MDA含量持續(xù)上升(圖9).

圖9 綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT酶活性以及MDA量的測定

3 分析與討論

3.1 綠草履蟲在水環(huán)境中對ZnO NPs的敏感度較高

通過ZnO NPs對綠草履蟲24h內(nèi)半致死濃度(0.39mg/L)和半最大效應(yīng)濃度(0.04mg/L)的測定，針對ZnO NPs的毒性，本研究所選用的纖毛蟲——綠草履蟲，對ZnO NPs的耐受程度與其他受試生物如大型溞(LC50=3.2mg/L)、秀麗隱桿線蟲(LC50=2.3mg/L)、斑馬魚(LC50=2.07mg/L)、尾草履蟲(EC50=0.44mg/L)等相比較弱[13-16].鑒于綠草履蟲對ZnO NPs有足夠的敏感性，且具有在水環(huán)境中數(shù)量多、形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的研究結(jié)果比較明確、容易獲得并容易在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)等特點(diǎn)，推薦綠草履蟲作為低濃度ZnO NPs在水環(huán)境中的指示生物.

3.2 ZnO NPs對綠草履蟲致毒機(jī)制的探索

對實(shí)驗(yàn)組綠草履蟲細(xì)胞表面進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)ZnO NPs破壞了綠草履蟲的表膜結(jié)構(gòu).透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)表膜泡中出現(xiàn)了多層圓形膜性結(jié)構(gòu)，推測與氧化應(yīng)激引起的自噬有關(guān).ZnO NPs所特有的光催化活性，使得它在光照條件下表面被激發(fā)出電子(e+)，留下電子空穴(h+)，-OH, O2和H2O可以與e+, h+反應(yīng)產(chǎn)生ROS[17].而綠草履蟲的趨光性使得ZnO NPs在水中產(chǎn)生的ROS更易對其產(chǎn)生毒害，因此綠草履蟲柔軟的表膜會(huì)直接受到水溶液中ROS的影響，這也許是綠草履蟲表膜泡異常、表膜破損的原因.也有研究表明ZnO NPs可以在大腸桿菌細(xì)胞膜表面結(jié)合并積累，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[18-19].

透射電鏡下發(fā)現(xiàn)ZnO NPs對綠草履蟲內(nèi)部的許多細(xì)胞器結(jié)構(gòu)造成了不同程度的損傷.線粒體結(jié)構(gòu)的破壞與綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生密切相關(guān).而線粒體功能的紊亂可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的失衡[20].線粒體大分子是氧化損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)，它們結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)使呼吸鏈解偶聯(lián)進(jìn)而導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生、氧化還原應(yīng)激、細(xì)胞因子產(chǎn)生和氧化磷酸化受損等[21].

目前的研究結(jié)果表明ZnO NPs主要通過誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生、Zn2+釋放、炎癥反應(yīng)、DNA損傷等途徑發(fā)揮毒性作用[22-23].DHE熒光探針直觀地反應(yīng)了ZnO NPs引起的綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)ROS的積累.證明ZnO NPs確實(shí)可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS失衡，使細(xì)胞遭受氧化脅迫.實(shí)驗(yàn)組綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)與抗氧化有關(guān)的SOD酶與CAT酶活性先上升后下降可能是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)活性氧的積累超過了細(xì)胞所承受的限度,導(dǎo)致細(xì)胞生物膜和酶系統(tǒng)被破壞.MDA含量持續(xù)上升說明綠草履蟲細(xì)胞內(nèi)酶抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)作用不足以與ZnO NPs誘導(dǎo)的氧化脅迫抗衡，綠草履蟲在處理過程中經(jīng)歷了嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng).結(jié)合電鏡對綠草履蟲表面及其內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果，推測ZnO NPs通過在水溶液中產(chǎn)生ROS破壞表膜結(jié)構(gòu)，并結(jié)合經(jīng)口攝入后在細(xì)胞內(nèi)部誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS破壞內(nèi)部細(xì)胞器，對綠草履蟲發(fā)揮毒性作用.

雖然ZnO NPs對綠草履蟲細(xì)胞的毒性明顯隨著溶液濃度的升高而增大，但從圖7可知，低濃度與高濃度的ZnO NPs溶液中顆粒本身所發(fā)揮的毒性相差無幾，這可能是ZnO NPs顆粒在高濃度溶液中易聚集的原因.濃度升高所引起綠草履蟲致死率的升高主要是ZnO NPs解離出的鋅離子對綠草履蟲的毒性作用.ZnO NPs對細(xì)胞毒性的發(fā)揮可能通過解離出鋅離子誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn).此研究結(jié)果提示抑制ZnO NPs在水中的溶解度可以提高ZnO NPs的安全性.另外，在研究ZnO NPs毒性作用時(shí)，所處溶液的pH值、離子強(qiáng)度、電解質(zhì)等影響ZnO NPs溶解的因素都應(yīng)給予考慮[24].