蒙藥梅花草化學成分抗腫瘤活性研究

阿如汗，紅 艷，達拉胡，辛 穎

（1. 內(nèi)蒙古民族大學 蒙醫(yī)藥學院，內(nèi)蒙古 通遼028000；2. 庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院 制劑室，內(nèi)蒙古 庫倫028200）

梅花草（孟根地格達）系虎耳草科梅花草屬植物梅花草（Parnassia palustrisLinn.）的干燥全草，具有破痞去滯、抑協(xié)日（清除血液中的濁物）和除熱解毒等功效，在蒙醫(yī)臨床實踐中用于治療肝血痞、間熱痞、內(nèi)熱痞、脈痞、腸協(xié)日痞、臟腑協(xié)日癥等［1-4］.依據(jù)蒙醫(yī)藥古籍文獻記載，梅花草的首要功效為破痞，破痞屬于蒙藥功效的一種分類類型，在現(xiàn)代蒙藥藥理學中破痞被描述為抗腫瘤作用［5］.通過本課題組的前期研究，發(fā)現(xiàn)梅花草的石油醚、二氯甲烷萃取部位是其抗腫瘤的活性部位，并從中分離得到11個單體化合物［6-8］.筆者將對梅花草二氯甲烷有效部位中分離的5種單體化合物成分celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein 和4-epi-alyxialactone 開展抗腫瘤活性篩選，旨在為進一步研究蒙藥梅花草的破痞藥效物質(zhì)基礎提供實驗數(shù)據(jù).

1 材料與儀器

1.1 原材料 本研究所用的藥材樣本采集于2015年7月，采集地為內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市扎魯特旗罕山，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院藥用植物學與鑒定學教研室徐都冷教授鑒定為梅花草（Parnassia palustrisLinn.），室內(nèi)陰干，待用.

1.2 實驗細胞株 實驗用細胞株（Hela、HepG2）均從上海博谷生物科技有限公司購買.

1.3 實驗藥物與試劑 化合物celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein、4-epi-alyxialactone 均由實驗室自制；胎牛血清（FBS）、細胞培養(yǎng)基（DMEM，高糖）、二甲基亞砜（DMSO，細胞用）、胰蛋白酶（1：250）、雙抗（青霉素、鏈霉素）、MTT等均從美國Gibco公司購買；生理鹽水、乙醇、二氯甲烷等分析純試劑均購自天津科密歐公司.

1.4 實驗儀器 TS100型倒置熒光顯微鏡（日本尼康）；SW-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州智凈有限公司）；3110 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific）；DNM-9602 型酶標儀（北京普朗責任有限公司）；YXQ-LS-100A型立式高壓鍋（上海博訊有限公司）；DHG-9203A型恒溫干燥箱（上海精宏有限公司）；KQ-100型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）.

2 實驗方法

2.1 化合物的制備 取約1.5 kg的干燥梅花草全草，使用95%乙醇回流提取，4h/次，共3次.經(jīng)減壓濃縮得梅花草的乙醇提取物.乙醇提取物被水混懸后，依次被石油醚、二氯甲烷萃取得40 g 石油醚萃取物和60 g二氯甲烷萃取物.梅花草的二氯甲烷萃取物經(jīng)硅膠色譜柱分離，流動相（石油醚：丙酮，v∶v=100∶1→10∶1）梯度洗脫，薄層鑒別后合并斑點相同的流份.其中，流份2（280 mg）經(jīng)適量石油醚溶解、過濾后，以石油醚-丙酮（v∶v=17∶1）為展開劑，薄層分離鑒別出化合物1（15 mg）和化合物2（11 mg）；流份3（405 mg）經(jīng)適量二氯甲烷溶解、過濾后，以石油醚-丙酮（v∶v=12∶1）為展開劑，薄層分離鑒別出化合物3（20 mg）、化合物4（14 mg）和化合物5（17 mg）.經(jīng)13C-NMR、1H-NMR核磁數(shù)據(jù)鑒定，結(jié)合文獻報道分析，化合物1～5分別為celahin B（1）、mussaenin A（2）、gardendiol（3）、isoboonein（4）和4-epi-alyxialactone（5）［9-13］.

2.2 抗腫瘤活性實驗

2.2.1 細胞培養(yǎng)及給藥 Hela、HepG2細胞的培養(yǎng)條件為：含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2、37℃的培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)48～72 h 傳代1 次.當腫瘤細胞的生長達到對數(shù)生長期時，可對其進行消化、計數(shù)和接種（96孔板的接種密度為1.0×105個/mL）.實驗分為空白對照組和藥物刺激組，加藥處理一般選擇接種后繼續(xù)培養(yǎng)的24 h 以后，每組8 個復孔.藥物刺激組包括分別加入化合物celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein和4-epi-alyxialactone 的不同濃度（25、50、75、100、200 μg/mL）組，空白對照組加入等體積的不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基.

2.2.2 MTT 法檢測抗腫瘤活性 藥物處理24 h可進行細胞活性檢測，先吸棄掉細胞培養(yǎng)板中每孔的培養(yǎng)基，加入MTT溶液（1mg/mL）50 μL/孔，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸掉MTT后加入DMSO（100 μL/孔），酶標儀（490 nm）檢測培養(yǎng)板中各實驗組的OD值，并計算各化合物對腫瘤細胞增殖的抑制率.抑制率等于空白對照組的平均OD值與藥物組平均OD值的差再除以空白對照組的平均OD值的比率.

2.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，各組實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析通過SPSS17.0軟件實現(xiàn)，當P＜0.05，則認為差異具有顯著性的統(tǒng)計學意義.

3 實驗結(jié)果

3.1 celahin B對腫瘤細胞增殖的影響 celahin B在濃度為50～200 μg/mL時，對Hela、HepG2細胞的增殖均有顯著的抑制作用，與對照組相比均具有統(tǒng)計學意義.當濃度為75 μg/mL及以上時，對Hela、HepG2細胞的增殖抑制率均大于50%.結(jié)果見表1.

表1 celahin B對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 1 Effect of celahin B on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.2 mussaenin A 對腫瘤細胞增殖的影響 mussaenin A 在濃度為75～200 μg/mL時，對Hela、HepG2細胞的增殖均有顯著的抑制作用，與對照組相比均具有統(tǒng)計學意義.當濃度為100 μg/mL及以上時，抑制率均可達到50%以上.結(jié)果見表2.

表2 mussaenin A對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 2 Effect of mussaenin A on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.3 gardendiol 對腫瘤細胞增殖的影響 在濃度為100～200 μg/mL 時，gardendiol 對Hela、HepG2 細胞的增殖均有顯著的抑制作用，當濃度為200 μg/mL時，對Hela細胞增殖抑制率大于50%.結(jié)果見表3.

表3 gardendiol對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 3 Effect of gardendiol on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.4 isoboonein 對腫瘤細胞增殖的影響 isoboonein 的濃度為100 μg/mL 及以上時，對Hela、HepG2 細胞的增殖才呈現(xiàn)出抑制活性.結(jié)果見表4.

表4 isoboonein對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 4 Effect of isoboonein on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.5 4-epi-alyxialactone 對腫瘤細胞增殖的影響 4-epi-alyxialactone 在濃度為50～200 μg/mL 時，對Hela、HepG2細胞的增殖均有顯著抑制.當濃度為75 μg/mL及以上時，抑制率大于50%.結(jié)果見表5.

表5 4-epi-alyxialactone對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 5 Effect of 4-epi-alyxialactone on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

4 討論

本課題組通過前期工作研究明確了梅花草的抗腫瘤活性，并篩選出其抗腫瘤的活性部位，探討其促腫瘤細胞凋亡的初步機制［14-16］.同時，利用常規(guī)柱色譜法從梅花草的抗腫瘤活性部位-二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物中分離得到11 個單體化合物（celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein、4-epi-alyxialac?tone、槲皮素、綠原酸、山奈酚、金絲桃苷、沒食子酸和山奈酚-3-O-β-蕓香糖苷）.經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，梅花草的化學成分槲皮素、綠原酸、山奈酚、金絲桃苷和沒食子酸均有不同程度抗Hela、HepG2細胞增殖的活性，且總體機制與誘導其凋亡相關［17-21］.

本研究通過體外實驗研究證實梅花草的化學成分celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein和4-epi-alyxialactone均有不同程度抑制Hela、HepG2細胞增殖的作用，并呈現(xiàn)出濃度依賴性.celahin B、4-epialyxialacton 對Hela 細胞和HepG2 細胞增殖具有很強的抑制活性，當濃度為75 μg/mL 時，抑制率分別為63.73%、63.45%和51.93%、49.69%；當應用celahin B、4-epi-alyxialacton 的最大安全濃度（200 μg/mL）時，抑制率可達72.11%、71.17%和64.63%、59.71%.mussaenin A 濃度為100 μg/mL 時，對Hela、HepG2 細胞增殖的抑制率是56.39%和48.62%.gardendiol 濃度為200 μg/mL 時，對Hela 細胞增殖的抑制率為56.42%.而化合物isoboonein 只有當濃度為200 μg/mL 時，才顯示出體外抑制腫瘤細胞增殖的活性，抑制率為43.77% 和34.37%.

綜上所述，梅花草中celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein 和4-epi-alyxialactone 等化學成分在體外均呈現(xiàn)出不同程度的抑制腫瘤細胞增殖的作用，該實驗結(jié)果可為進一步開展蒙藥梅花草破痞功效的藥效物質(zhì)基礎研究提供參考.