黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙卡和儀器技術(shù)性能優(yōu)化研究*

鞏性濤 王 培 肖理文 宋永泉 徐 秀 趙 皖

(1 山東省糧油檢測中心 250101)(2 南京微測生物科技有限公司 210000)

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1簡寫為AFB1)是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌铮幸粋€雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)?香豆素)，具有強致癌性以及劇毒性，是迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種。從1993年開始黃曲霉毒素被認(rèn)定為世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機構(gòu)劃定的一類致癌物，是世界公認(rèn)的三大強致癌物質(zhì)之一，而黃曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是危害最大的一種黃曲霉毒素[1]。

黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴(yán)重，北方黃淮地區(qū)特別是玉米、小麥、花生污染程度上升尤為明顯[2]。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2011)中對糧食谷物及其制品中黃曲霉毒素B1的最高限量為20 μg/kg，《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078-2001)中對不同種類的飼料中黃曲霉毒素B1的最高限量標(biāo)準(zhǔn)從10 μg/kg～50 μg/kg不等。

目前，國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1采用HPLC法，需要大型的儀器設(shè)備，價格昂貴，操作過程復(fù)雜、時間較長，且無法在現(xiàn)場和基層小型實驗室使用。除此之外，也有采用黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙卡用于大量樣品的篩查，操作簡便，檢測快速，成本也較低，但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，容易造成假陽性或者假陰性，國外同類進口設(shè)備和試劑條準(zhǔn)確性和重復(fù)性雖然有所提高，但成本高，糧油收儲、糧食加工和飼料企業(yè)難以接受。為此，山東糧油檢測中心與南京微測生物科技有限公司對基于熒光定量免疫層析平臺的黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙卡進行了產(chǎn)品的進一步優(yōu)化升級，使之操作簡單、準(zhǔn)確性和重復(fù)性較高，且使用成本較進口降低30%，能更好滿足不同客戶的日常檢測需求，確保糧食和食品安全。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

除注明外，均為分析純，試驗用水均為國標(biāo)一級標(biāo)準(zhǔn)蒸餾水。

黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙卡由乳膠墊、NC膜、樣品墊及吸收墊組成，乳膠墊上包裹有熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素B1抗體；NC膜上噴涂有黃曲霉毒素B1抗原的檢測線和噴涂有羊抗兔二抗的控制線。樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均為上海生產(chǎn)。黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma公司；大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)獲得。麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從糧食加工和收儲企業(yè)獲得。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-600型熒光免疫定量分析儀和FD-2000型試紙卡恒溫孵育器：上海生產(chǎn)；低速離心機：上海生產(chǎn)；漩渦混勻器：海門生產(chǎn)；電子天平：Sartorius。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理 取具有代表性的待測樣品500 g，用粉碎機粉碎1 min后過20目篩，收集過篩后的均勻細(xì)小樣品。稱取過篩后的樣品5.0 g±0.02 g于50 mL離心管中，加入25 mL提取液，用漩渦混勻器振蕩5 min(或者搖床振蕩5 min)后，4000RPM離心2 min。

1.3.2 檢測過程 取100 μL離心上清液加入500 μL 樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3 s～5 s，然后取100 μL加入到黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙卡的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育8 min，8 min后將試紙卡插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，讀數(shù)值即為樣品的實際檢測濃度。當(dāng)檢測值大于75 μg/kg時，可將離心上清液稀釋5倍后再進行檢測，所得讀數(shù)值乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗結(jié)果。

1.3.3 試紙卡原理 當(dāng)將待測樣品滴加在試紙卡加樣區(qū)時，樣品中的黃曲霉毒素B1與結(jié)合墊中熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗體結(jié)合并通過毛細(xì)作用向前層析，到達檢測區(qū)后，檢測線T線上固定的黃曲霉毒素B1抗原與剩余未結(jié)合的熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素B1抗體結(jié)合。檢測線T線上結(jié)合的熒光微球標(biāo)記抗體的量與樣品中待測物的量成反比，質(zhì)控線C線結(jié)合的熒光標(biāo)記物與樣品中待測物的量無關(guān)，剩余或其它熒光標(biāo)記物繼續(xù)層析達到吸收區(qū)。反應(yīng)結(jié)束后，使用熒光定量快速檢測儀讀取T線和C線的熒光強度并計算T/C值，通過儀器內(nèi)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出樣品中黃曲霉毒素B1的含量。

1.3.4 試紙卡優(yōu)化 在單T線的基礎(chǔ)上，增加1條矯正T線，形成質(zhì)控線C線1條、檢測線T線2條的方式。

2 結(jié)果分析

2.1 黃曲霉毒素B1試紙卡檢測線數(shù)量由兩線優(yōu)化成三線的實驗結(jié)果

選用國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本中分別添加黃曲霉毒素B1的濃度為2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg，然后按照黃曲霉毒素B1試紙卡檢測方法同時進行兩線及三線試紙卡檢測，每個加標(biāo)樣本各檢測2個平行樣，對比試紙卡靈敏度，檢測結(jié)果見表1；選取高、中、低3個加標(biāo)濃度點，每個加標(biāo)樣本檢測6個平行樣，檢測對比試紙卡的重復(fù)性，檢測結(jié)果見表2。

表1 黃曲霉毒素B1兩線與三線試紙卡的靈敏度 (單位：μg/kg)

表2 黃曲霉毒素B1兩線與三線試紙卡的重復(fù)性 (濃度單位：μg/kg)

從表1可知，黃曲霉毒素B1三線試紙卡的2.5 μg/kg檢測靈敏度為22.03%；兩線試紙卡的2.5 μg/kg檢測靈敏度為16.39%；從單一2.5 μg/kg濃度點檢測靈敏度對比，三線試紙卡靈敏度更高；且綜合對比不同濃度的檢測靈敏度，也得出黃曲霉毒素B1三線試紙卡靈敏度較兩線試紙卡更高。從樣本加標(biāo)檢測靈敏度對比，可選黃曲霉毒素B1三線試紙卡。

從表2可知，篩選高、中、低三個濃度點進行重復(fù)性檢測，黃曲霉毒素B1三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍為4.26%～8.11%；兩線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍為7.50%～11.25%；對比三線試紙卡與兩線試紙卡的檢測變異系數(shù)CV范圍，三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍更小，重復(fù)性更高；從樣本加標(biāo)檢測重復(fù)性對比，可選黃曲霉毒素B1三線試紙卡。

綜合黃曲霉毒素B1三線試紙卡與兩線試紙卡的靈敏度與重復(fù)性對比，選擇黃曲霉毒素B1三線試紙卡。

2.2 選用檢測線數(shù)量為三線的黃曲霉毒素B1試紙卡進行產(chǎn)品性能檢測

2.2.1 黃曲霉毒素B1試紙卡檢出限及定量限實驗結(jié)果 選用國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本20份，然后按照黃曲霉毒素B1試紙卡檢測方法進行檢測，每個樣本檢測1個試紙卡。檢測結(jié)果見表3。

由表3中檢測數(shù)據(jù)分析可知：黃曲霉毒素B1試紙卡的檢出限為0.4 μg/kg；定量限為0.983 μg/kg。

2.2.2 黃曲霉毒素B1試紙卡的檢測范圍的實驗結(jié)果 選用國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本中分別添加黃曲霉毒素B1的濃度為1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、75 μg/kg，然后按照黃曲霉毒素B1試紙卡檢測方法進行檢測，每個加標(biāo)樣本各檢測2個平行樣。檢測結(jié)果見表4。

通過表4的檢測數(shù)據(jù)可知，在空白樣本中添加黃曲霉毒素B1的濃度為1 μg/kg時，檢測靈敏度為10.41%，與空白樣本檢測存在梯度差；陰性樣本加標(biāo)濃度從1 μg/kg～75 μg/kg時，檢測靈敏度范圍為10.41%～95.07%，且不同濃度點檢測抑制率分散率較好，故黃曲霉毒素B1可定量檢測范圍為1 μg/kg～75 μg/kg。

表4 黃曲霉毒素B1試紙卡的檢測范圍 (單位：μg/kg)

2.2.3 黃曲霉毒素B1試紙卡的準(zhǔn)確度和重復(fù)性實驗結(jié)果 選用國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本中分別添加黃曲霉毒素B1濃度為1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、75 μg/kg，然后按照黃曲霉毒素B1熒光定量試紙卡的檢測方法進行檢測，每個加標(biāo)樣本各檢測3個平行樣。檢測結(jié)果見表5。

通過表5可知，大米樣本的加標(biāo)回收率為88.34%～103.17%；玉米樣本的加標(biāo)回收率為85.72%～109.09%；小麥樣本的加標(biāo)回收率為95.40%～117.53%；綜合三種不同基質(zhì)樣本加標(biāo)檢測回收率范圍為85.72%～117.53%，說明樣本加標(biāo)檢測回收率高，黃曲霉毒素B1試紙卡檢測準(zhǔn)確度較高。

表5 黃曲霉毒素B1試紙卡的準(zhǔn)確度和重復(fù)性 (單位：μg/kg)

大米樣本的變異系數(shù)CV范圍為0.64%～10.81%；玉米樣本的重變異系數(shù)CV范圍為3.29%～11.25%，小麥樣本的變異系數(shù)CV范圍為2.19%～11.58%；綜合三種不同基質(zhì)樣本加標(biāo)檢測變異系數(shù)CV范圍為0.64%～11.58%，說明黃曲霉毒素B1試紙卡整體變異系數(shù)CV較小，試紙卡重復(fù)性較好。

2.2.4 黃曲霉毒素B1試紙卡穩(wěn)定性的實驗結(jié)果 黃曲霉毒素B1檢測在2℃～10℃環(huán)境下，并在每個月固定日期進行樣本檢測，篩選固定不同基質(zhì)已知不同濃度值樣本(拜發(fā)質(zhì)控物)用于試紙卡穩(wěn)定性檢測，每個樣本檢測1個試紙卡，檢測結(jié)果見表6。

表6 黃曲霉毒素B1試紙卡的穩(wěn)定性

通過表6數(shù)據(jù)可知，黃曲霉毒素B1試紙卡在2℃～10℃保存8個月，不同基質(zhì)樣本的檢測偏差范圍為4.92%～10.82%，說明黃曲霉毒素B1試紙卡在正常溫度8個月的保存整體偏差在10%以內(nèi)，說明產(chǎn)品穩(wěn)定性較好。

2.3 利用黃曲霉毒素B1試紙卡測定儀器的穩(wěn)定性與臺間差

2.3.1 采用一臺儀器設(shè)備，每小時測定固定值樣本濃度，連續(xù)測定12次，以該方法12 h測定數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差和極差是否超過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求來考察設(shè)備穩(wěn)定性。檢測結(jié)果見表7。

通過表7的計算分析可知，該儀器測定的穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)差和極差均沒有查過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求，儀器穩(wěn)定性好。

表7 儀器的穩(wěn)定性

2.3.2 兩臺設(shè)備分別對6個濃度梯度的玉米樣本進行雙試驗檢測，采用配對t檢驗法比較兩臺儀器的檢測結(jié)果是否存在顯著差異。檢測結(jié)果見表8。

表8 儀器的臺間差 (單位：μg/kg)

由表8的分析數(shù)據(jù)可知，td=0.43，查t分布表，t0.05,5=2.5706，td

2.4 設(shè)備與產(chǎn)品優(yōu)化后進行玉米粉中黃曲霉毒素B1不同單位驗證檢測

通過表8～表16的計算分析可知，驗證單位1、驗證單位2、驗證單位3三家驗證單位檢測結(jié)果平均值也符合國家標(biāo)準(zhǔn)適用性要求，說明設(shè)備與產(chǎn)品穩(wěn)定性較好。

表9 檢出限與定量限：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表10 濃度水平1準(zhǔn)確性結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表11 濃度水平2準(zhǔn)確性結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表12 濃度水平3準(zhǔn)確性結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表13 濃度水平1臺間差結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表14 濃度水平2臺間差結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表15 濃度水平3臺間差結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表16 濃度水平2重復(fù)性結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

2.5 優(yōu)化試紙卡與其他產(chǎn)品檢測對比

通過表17中優(yōu)化產(chǎn)品同國外知名品牌產(chǎn)品對同一樣本檢測數(shù)據(jù)對比，從CV與回收率數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化產(chǎn)品檢測效果優(yōu)于進口產(chǎn)品，說明可以取代進口產(chǎn)品。

表17 優(yōu)化產(chǎn)品與進口產(chǎn)品黃曲霉毒素B1質(zhì)控品檢測結(jié)果 (單位：μg/kg)

3 結(jié)論

從黃曲霉毒素?zé)晒舛吭嚰埧ㄈ€與兩線的靈敏度、不同濃度點梯度與重復(fù)性等的檢測數(shù)據(jù)對比可知，三線試紙卡靈敏度更高；不同濃度點分布更合理，且三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍更小，重復(fù)性更高。且通過對三線試紙卡檢測限、檢測范圍、不同基質(zhì)樣本重復(fù)、穩(wěn)定性等檢測驗證實驗可知，優(yōu)化后三線試紙卡的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等均達到更優(yōu)的效果，更能滿足檢測需求。另外熒光定量分析儀根據(jù)重復(fù)性要求，儀器穩(wěn)定性好且兩臺設(shè)備的測定結(jié)果之間不存在顯著性差異。

綜上所述，普通免疫層析快檢產(chǎn)品通常采用單檢測線(T線)定量方法，產(chǎn)品研發(fā)周期更短，生產(chǎn)工藝更為簡單，成本也更低，但檢測結(jié)果的精密度難以控制，導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性較差。黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙卡在單T線的基礎(chǔ)上，增加一條矯正T線，與質(zhì)控線(C線)一起，形成“雙保險”，大大提升了檢測結(jié)果的精密度和重復(fù)性。