燥邪對(duì)健康大鼠氣管和肺內(nèi)細(xì)小支氣管黏膜組織肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白-D表達(dá)的影響

劉姍姍，王麗鑫，張旺旺，史 紅

(新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000)

燥邪為中醫(yī)外感六淫邪氣之一，具有“燥性干澀，易傷津液”等致病特點(diǎn)。我國(guó)以新疆為代表的西北部地區(qū)，地處沙漠邊緣，干旱半干旱是其特有的氣候特征。有研究指出，我國(guó)西北“燥發(fā)無(wú)時(shí)，非獨(dú)秋有，燥氣偏盛”，其民常罹患西北燥證而變生他疾[1]。肺泡表面活性物質(zhì)(Pulmonary surfactant,PS)相關(guān)蛋白(Suractant-associated protein,SP)中的蛋白-D(SP-D)是肺先天防御系統(tǒng)的主要分子，也是肺組織抵御感染的一道防線[2]。又中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺與外界相通為“嬌臟”，易為燥邪所傷，故本研究著眼于與外環(huán)境直接接觸的氣道黏膜以及肺內(nèi)細(xì)小氣道黏膜組織，在實(shí)驗(yàn)室營(yíng)造秋燥之邪(以下簡(jiǎn)稱輕度燥邪)和西北方域燥邪(以下簡(jiǎn)稱重度燥邪)，比較二者對(duì)健康大鼠氣道和肺內(nèi)細(xì)小支氣管黏膜組織形態(tài)學(xué)及SP-D表達(dá)的影響，探討燥邪犯肺或?qū)е聶C(jī)體亞健康狀態(tài)的微觀機(jī)制，以期為研究西北燥證主證(又稱肺衛(wèi)孔竅皮膚燥證)的證候機(jī)制尋找線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)干預(yù)：將60只SPF級(jí)SD雌鼠[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK(新)2011-0004,140～160 g,鼠]按體重隨機(jī)均分為六組，即正常對(duì)照組(N-24 d和N-48 d)置于常溫(21 ℃)常濕(相對(duì)濕度50%～55%)SPF級(jí)環(huán)境中；秋燥組(D-24 d和D-48 d)置于人工氣候箱中予輕度燥邪；西北燥組(D&D-24 d和D&D-48 d)在人工氣候箱和砂塵試驗(yàn)箱內(nèi)予重度燥邪；全部大鼠普食飼喂，干預(yù)24 d和48 d。

1.1.2 主要儀器：改造后的PRX-1250B型程控智能人工氣候箱(上海德洋意邦儀器有限公司)，DSC-1000型砂塵試驗(yàn)箱(江蘇博科)。

1.1.3 主要試劑：博士德兔抗SP-D抗體(1∶50)。Abcom兔抗SP-D抗體(1∶2000)，3% H2O2(山東德新康)。兔二步法試劑盒、0.01 mol/L枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液、羊血清封閉液、DAB顯色試劑盒、蘇木素染液、伊紅染液、0.01 mol/L PBS緩沖液均使用中杉金橋產(chǎn)品。

1.1.4 標(biāo)本的采集與制備：干預(yù)結(jié)束后禁食不禁水16 h以上，之后用10%水合氯醛腹腔注射保定大鼠，腹主動(dòng)脈采血后迅速摘取上氣道和右肺中葉組織，在4 ℃生理鹽水中洗3遍，用4%多聚甲醛固定組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制備石蠟切片。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 秋燥組(輕度燥邪)模擬：參考燥邪模擬方案[3]，人工氣候箱溫度的設(shè)定采用方案中Ⅰ類和Ⅲ類參數(shù)(6～24 ℃和10～30 ℃)、相對(duì)濕度為5%～45%，日均相對(duì)濕度(24.33±11.29)%，風(fēng)速3 m/s，光照度 5～20 LX且日照總時(shí)數(shù)遞減，以此模擬輕度燥邪。

1.2.2 西北燥組(重度燥邪)模擬：參考燥邪模擬方案[3]，人工氣候箱溫度的設(shè)定采用方案中Ⅰ-Ⅳ類溫度參數(shù)，日溫差也隨Ⅰ-Ⅳ類溫度參數(shù)的不同分別進(jìn)行設(shè)定；光照度設(shè)定為5～20 LX，但適時(shí)遞增和遞減日照總時(shí)數(shù)以模擬四季日照；同時(shí)使用砂塵試驗(yàn)箱進(jìn)行風(fēng)沙干預(yù)，設(shè)定風(fēng)速為6～8 m/s，粒徑小于10 μm浮塵吹塵20 min/次，浮塵量300 g/(m3·次)，兩次吹塵間隔10 min，干預(yù)強(qiáng)度1 h/d，以此模擬重度燥邪。

1.2.3 HE染色：石蠟切片，60 ℃溫箱烤片40 min，常規(guī)脫蠟,蘇木素染色2 min,自來(lái)水洗去多余染液,伊紅染色1 min,自來(lái)水洗去多余染液,后用1%鹽酸乙醇分化3 s,0.01 mol/L PBS反藍(lán)1 min,后依次放入80%乙醇、95%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ和無(wú)水乙醇、兩組透明液中各5 s,自然晾干后封片按1.1.4免疫組化染色,60 ℃溫箱烤片，常規(guī)脫蠟，0.01 mol/L PBS緩沖液清洗5 min,連續(xù)3次；浸入3% H2O2中10 min，之后入0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液中煮10 min(92～98 ℃)，自然放涼，切片甩干，滴羊血清封閉液(80 μl/標(biāo)本)，30 min后甩干并滴加一抗，其中肺組織使用兔抗SP-D抗體(Abcam,濃度1∶2000，80 μl/標(biāo)本)，氣道使用兔抗SP-D抗體(博士德,濃度1∶50,40 μl/標(biāo)本)；濕盒中4 ℃過(guò)夜，次日復(fù)溫1 h后甩干，入0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，滴加二抗(100 μl/標(biāo)本)后室溫反應(yīng)40 min，甩干后入0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次,DAB顯色。自來(lái)水洗后入蘇木素復(fù)染2 min，用自來(lái)水洗3遍，再入1%鹽酸乙醇中分化1 s，自來(lái)水反藍(lán)1 min，依次放入80%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、兩組透明液中各5 s，晾干后用中性樹(shù)膠封片備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Image-Pro Plus 6.0 分析免疫組化圖像圖像并記錄積分光密度(IOD)，采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)(方差齊時(shí))或近似t檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))；多組組間平均IOD值進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，當(dāng)組間方差齊時(shí)，用最小顯著性差異法(LSD)，當(dāng)組間方差不齊時(shí)用多元Tamhane’s T2。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 燥邪對(duì)健康大鼠氣道組織形態(tài)學(xué)的影響 鏡下N-24 d組和N-48 d組大鼠氣管結(jié)構(gòu)完整，假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞排列有序，未見(jiàn)黏膜腫脹、充血、增生、斷裂脫落及炎性改變。D-24 d組假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮部分脫落、分布稀疏，出現(xiàn)局灶性增生、充血和炎性浸潤(rùn)。相較于D-24 d組，D-48 d組大鼠氣管增生、充血明顯伴多發(fā)炎性病灶，并見(jiàn)黏膜斷裂缺失，假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞排列紊亂。D&D-24 d組黏膜顯著增生、充血腫脹明顯，黏膜及黏膜下層大面積炎性浸潤(rùn)，黏膜表層見(jiàn)塵土顆粒。D&D-48 d組氣管，假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮損傷有所修復(fù)，細(xì)胞增殖，上皮層加厚，呈指狀突出樣改變，黏膜層結(jié)構(gòu)不完整，纖毛量有所恢復(fù)。氣管腺處依舊可見(jiàn)炎性細(xì)胞。提示重度燥邪干預(yù)下，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，氣道組織形態(tài)學(xué)損傷有所修復(fù)(圖1)。

圖1 各組SD大鼠氣管組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×200)

2.2 燥邪對(duì)健康大鼠氣道黏膜SP-D的表達(dá) 各組大鼠氣道黏膜組織SP-D表達(dá)的IOD均值見(jiàn)表1。氣道黏膜SP-D表達(dá)量在N-24 d組和N-48 d組組間、在N-24 d組、D-24 d組和D&D-24 d組組間所顯現(xiàn)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但N-48 d組、D-48 d組和D&D-48 d組大鼠氣道黏膜SP-D表達(dá)的組間兩兩比較結(jié)果顯示，D-48 d組氣道黏膜SP-D表達(dá)量分別高于N-48 d組(P<0.05)和D&D-48 d組(P<0.05)。而對(duì)N-24 d組、D-24 d組和D-48 d組氣道黏膜SP-D表達(dá)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果亦顯示D-48 d組氣道黏膜SP-D表達(dá)量分別高于N-24 d組(P<0.05)和D-24 d組(P<0.05)。但N-48 d組、D&D-24 d組和D&D-48 d組大鼠氣道黏膜SP-D表達(dá)的組間兩兩比較結(jié)果顯示，上述三組組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示長(zhǎng)期處于輕度燥邪干預(yù)下大鼠氣道黏膜SP-D表達(dá)出現(xiàn)升高的現(xiàn)象，但重度燥邪干預(yù)下大鼠氣道黏膜SP-D的表達(dá)卻未出現(xiàn)上述現(xiàn)象(圖2)。

表1 輕度燥邪和重度燥邪干預(yù)下健康大鼠氣道黏膜SP-D表達(dá)

圖2 各組SD大鼠氣道黏膜SP-D表達(dá)(免疫組化染色，×200)

2.3 燥邪對(duì)健康大鼠肺內(nèi)細(xì)小支氣管SP-D的表達(dá) 表2所示為各組大鼠肺內(nèi)細(xì)小支氣管黏膜組織SP-D表達(dá)的IOD均值。肺內(nèi)細(xì)小支氣管黏膜SP-D表達(dá)在N-24 d組和N-48 d組組間、N-24 d組、D-24 d組和D&D-24組三組之間、N-48 d組、D-48 d組和D&D-48 d組組間、N-24 d組、D-24 d組、D-48 d組三組組間、在N-48 d組、D&D-24 d組和D&D-48 d組三組組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 輕度燥邪和重度燥邪干預(yù)下健康大鼠肺內(nèi)小支氣管SP-D的表達(dá)

3 討 論

PS是由脂質(zhì)和疏水性表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白組成的復(fù)合物[3]，主要由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生。PS分布于肺泡內(nèi)且具有降低氣液界面表面張力、維持氣道穩(wěn)定性及氣道內(nèi)液體平衡的作用[4-5]。PS是肺和氣道固有免疫功能的重要組成部分，肺泡表面PS可形成防止吸入性物質(zhì)擴(kuò)散的屏障，保護(hù)氣道免受外來(lái)藥物、變應(yīng)原的刺激，還可通過(guò)改善顆粒和細(xì)菌從外周氣道向中央氣道的運(yùn)輸來(lái)提高支氣管的清除率[6-9]。 SP-D是膠原凝集素家族的親水性大分子糖蛋白，主要由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌，占PS總重量的1%，屬于模式識(shí)別分子(Pattern recognition molecules,PRMS)[2]。SP-D不僅在肺和氣道表達(dá)，更可廣泛表達(dá)在體內(nèi)其他組織的上皮表面，SP-D同時(shí)具有固有免疫蛋白的全部特性，它不僅可以調(diào)節(jié)肺泡表面張力，穩(wěn)定肺泡內(nèi)壓，增加肺的順應(yīng)性，減少肺組織液生成而防止肺水腫，亦可通過(guò)與黏膜束內(nèi)的上皮細(xì)胞及適應(yīng)性免疫細(xì)胞、先天免疫細(xì)胞的受體相互作用以發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能，并結(jié)合細(xì)菌和真菌，募集病毒，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，在宿主防御和炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是呼吸系統(tǒng)疾病病理機(jī)制和藥理機(jī)制研究的常用研究指標(biāo)[10-14]。

本研究結(jié)果顯示，燥邪可引起氣道組織形態(tài)學(xué)的異常改變。輕度燥邪干預(yù)下，大鼠氣道假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮部分脫落、局灶性增生、充血和炎性浸潤(rùn)，損傷程度隨干預(yù)時(shí)長(zhǎng)增加加重。此現(xiàn)象可能與燥邪性質(zhì)相關(guān)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，燥邪致病多有干燥收斂，清肅之特性，屬陰中之陽(yáng)，多為秋季燥熱之氣轉(zhuǎn)化而成。其性干澀，易傷津耗液，最易傷肺，當(dāng)氣道受燥邪侵犯，氣道內(nèi)津液損耗，失于濡養(yǎng)從而更易引發(fā)并加重氣道炎癥反應(yīng)。與氣道組織形態(tài)學(xué)改變相同，氣道黏膜SP-D表達(dá)隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)亦出現(xiàn)增高的趨勢(shì)，此與云南春燥環(huán)境可使小鼠氣道內(nèi)SP-D含量上升的研究結(jié)果相一致[15-18]。依據(jù)血清SP-D水平升高可以作為氣道炎癥的生物標(biāo)志物，尤指慢性氣道炎癥的生物標(biāo)志物[19]；急性肺損傷時(shí)肺組織SP-D升高考慮為保護(hù)性因素等研究結(jié)果[20-21]。本研究推斷當(dāng)機(jī)體感受秋燥之邪進(jìn)行免疫自主調(diào)節(jié)，通過(guò)上調(diào)氣道黏膜SP-D表達(dá)以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分泌來(lái)吞噬病原體，調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)以增強(qiáng)對(duì)秋燥之邪的抵抗力。與輕度燥邪相比，重度燥邪干預(yù)下大鼠氣道增生、充血明顯，可見(jiàn)大面積炎性浸潤(rùn)，黏膜表層可見(jiàn)塵土顆粒，干預(yù)后期有所修復(fù)。但氣道黏膜SP-D表達(dá)未發(fā)生明顯改變，兩種不同程度燥邪干預(yù)下出現(xiàn)的差異，提示秋燥之邪和西北方域燥邪不同干預(yù)條件下氣道黏膜的固有免疫機(jī)制可能有所區(qū)別。與氣道黏膜SP-D表達(dá)的變化不同，肺內(nèi)細(xì)小氣道黏膜SP-D表達(dá)在各組組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明燥邪對(duì)健康機(jī)體肺內(nèi)細(xì)小氣道黏膜SP-D表達(dá)未造成直接影響。此外，本研究中西北方域燥邪干預(yù)下大鼠氣道損傷狀況于后期有所修復(fù)，但此現(xiàn)象與氣道黏膜SP-D表達(dá)不相關(guān)，可推測(cè)該現(xiàn)象或與其他蛋白通路相關(guān)，但其具體的病理機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究探索。本研究據(jù)此推斷，氣道黏膜SP-D異常表達(dá)可能是燥邪致病亞健康狀態(tài)的微觀機(jī)制之一，或可用于闡釋“肺為嬌臟”和“燥易犯肺”之中醫(yī)學(xué)理論；而秋燥之邪和西北方域燥邪對(duì)氣道黏膜SP-D表達(dá)影響的差異性則提示，氣道黏膜SP-D表達(dá)可作為西北燥證證候機(jī)制研究的線索之一。