地龍?zhí)崛∥锿ㄟ^抑制TGF-β1信號通路發(fā)揮抗肺纖維化作用研究

陳 宏，張 偉，郭建波，蘇玉明，宋倩男，陳 群，趙 猛

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱市阿城區(qū)人民醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150300)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是由多種彌漫性肺間質(zhì)疾病引起的肺組織病理改變，近年來多種中藥復(fù)方提取物針對肺纖維化動物模型呈現(xiàn)出顯著的治療效果[1]。肺纖維化通常因為臨床表現(xiàn)呼吸困難，進(jìn)而會引發(fā)呼吸衰竭而死亡，一般發(fā)生后，存活時間相對都不長，面對這樣的機(jī)制目前還沒有比較明確的研究支撐。但近年來，隨著對本病發(fā)病機(jī)制和病理生理變化的深入研究和分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，治療上有了新的進(jìn)展[4]。本研究主要運用地龍?zhí)崛∥飳σ种芓GF-β1(Ttransforming growth factor-β1，TGF-β1)信號通路誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺成纖維細(xì)胞的活化，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)液：RPMI1640 培養(yǎng)基購于Beijing Solarbio Science&Technology Co，Ltd，MEM 培養(yǎng)基購于博士德生物有限公司，胎牛血清購于浙江天杭生物技術(shù)有限公司，Human TGF-β1 為Pepro Tech Inc 產(chǎn)品。

1.1.2 抗體及試劑盒：E-cadherin 抗體、Collagen-Ⅰ 抗體以及 SABC 即用型免疫組化試劑盒均為博士德生物有限公司產(chǎn)品；Human Collagen Type Ⅰ ELISA Kit 和 Human Fi-bronectin (FN) ELISA Kit 均為Sangon Biotech Co.Ltd產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國 Thermo公司)、酶標(biāo)儀(美國 Thermo公司)。倒置熒光相差顯微鏡(Olympus CKX41-A32PH)、數(shù)碼相機(jī)(日本 OLYPUS公司)。

1.2 地龍?zhí)崛∥飳?A549 細(xì)胞和 MRC-5 細(xì)胞增殖的影響 MTT 法檢測地龍?zhí)崛∥锏募?xì)胞毒性。通過運用培養(yǎng)液，進(jìn)行平均吸光度值進(jìn)行檢測，按照正?？椎钠骄舛戎底鳛?100% ，其他孔的吸光度值除以正?？椎钠骄舛戎?，乘以 100%，作為每孔的生存率。將本實驗的小鼠分為三組：正常組、TGF-β1組和地龍組，各10只。

1.3 TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞的EMT及地龍?zhí)崛∥锏母深A(yù) TGF-β1誘導(dǎo)A549肺泡上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化和MRC-5肺成纖維細(xì)胞的活化；圓形度定量法分析細(xì)胞形態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞E-鈣黏附素(E-cadherin，E-cad)和Collagen-Ⅰ蛋白的表達(dá)。

1.4 Collagen-Ⅰ和FN的Elisa檢測 吸出每孔的培養(yǎng)液，×1000 g、4 ℃ 離心 10 min；上清液按照試劑盒說明書采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)液中的Collagen-Ⅰ和FN 含量，以ng/ml 表示。

2 結(jié) 果

2.1 地龍?zhí)崛∥飳549細(xì)胞圓形度、E-cad和Collagen-I蛋白表達(dá)的影響 見表1。對于A549細(xì)胞，與正常組比較，TGF-β1組圓形度和E-cad表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)，Collagen-Ⅰ表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與TGF-β1組比較，地龍組能顯著抑制E-cad表達(dá)的下調(diào)(P<0.05)，地龍組能顯著抑制Collagen-Ⅰ表達(dá)的上調(diào)(P<0.05)。

表1 地龍?zhí)崛∥飳549細(xì)胞圓形度、E-cad和Collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)(IOD/Area)的影響

2.2 地龍?zhí)崛∥飳RC-5細(xì)胞Collagen-Ⅰ和FN蛋白表達(dá)的影響 見表2。對于MRC-5細(xì)胞，與正常組比較，TGF-β1組FN、Collagen-Ⅰ的分泌量均顯著增加(均P<0.01)；與TGF-β1組比較，地龍組的上述兩種蛋白的分泌量均顯著減少(均P<0.05)。

表2 地龍?zhí)崛∥飳?MRC-5細(xì)胞Collagen-Ⅰ和FN蛋白表達(dá)的影響(ng/ml)

3 討 論

間質(zhì)性肺疾病(Interstitial lung disease，ILD)可能是不明原因或是毒素、過敏原從外部侵襲所引起，如果潛藏的危險因素沒有被發(fā)現(xiàn)，就會被診斷為原發(fā)性間質(zhì)性肺炎[5-6]。肺纖維化是一種慢性發(fā)炎及漸進(jìn)式間質(zhì)纖維化的疾病[7-10]。整個肺纖維化疾病發(fā)展的過程中，發(fā)炎反應(yīng)和間質(zhì)細(xì)胞增生程度扮演很重要的角色，造成肺部表皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮的損傷，使正常結(jié)構(gòu)破壞。接著是發(fā)炎反應(yīng)及釋出多種調(diào)控激素，如細(xì)胞激素，化學(xué)激素及生長因子等，這些會造成纖維母細(xì)胞的移位、增生和分泌更多的細(xì)胞外基質(zhì)。IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、PDGF、IGF及TGF-β等是屬于促發(fā)炎及纖維化的細(xì)胞激素，造成細(xì)胞外間質(zhì)大量增加，逐漸變成纖維化[11-12]。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)在腫瘤生物學(xué)中具有抑制腫瘤和促進(jìn)腫瘤的雙重作用。TGF-β1多肽類蛋白作為腫瘤抑制因子抑制上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞的增殖。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，它們對TGF-β1介導(dǎo)的生長抑制產(chǎn)生抵抗，并過表達(dá)TGF-β1[13-14]。此時，TGF-β1促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。TGF-β1多效性信號通路是開發(fā)腫瘤治療靶向藥物的一個挑戰(zhàn)。目前，癌癥治療學(xué)的一些發(fā)展目標(biāo)是在臨床前和臨床藥物開發(fā)項目。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMTs)發(fā)生在許多動物物種胚胎發(fā)育的關(guān)鍵階段[15-16]。EMT為了解腫瘤向去分化和惡性階段的進(jìn)展提供了一個新的基礎(chǔ)。由基底膜構(gòu)成的正常上皮可在局部增生而形成腺瘤[16]。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)變，由表觀變化和遺傳改變導(dǎo)致原位癌。進(jìn)一步的改變可能通過上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化引起局部癌細(xì)胞擴(kuò)散，基底膜破碎。這些細(xì)胞可以通過靜脈進(jìn)入淋巴或血管，使它們被動運輸?shù)竭h(yuǎn)處的器官[17]。分化標(biāo)記的表達(dá)從E-鈣黏蛋白等細(xì)胞連接蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)標(biāo)記，包括N-鈣黏蛋白和纖維連接蛋白。此外，靜止細(xì)胞轉(zhuǎn)化為可通過細(xì)胞外基質(zhì)侵襲的遷移細(xì)胞[18]。

中醫(yī)學(xué)則將本病歸入“咳嗽”“肺痿”“喘證”“肺脹”等范疇，是多種肺疾病發(fā)展到晚期共同的病理變化，主要病機(jī)在于虛、瘀，臨床多見氣陰不足，瘀血阻絡(luò)。所以，中醫(yī)治療總以補(bǔ)肺生津，活血通絡(luò)為原則，在文獻(xiàn)中，我們可見養(yǎng)肺活血湯、血府逐淤湯、補(bǔ)氣通肺飲等中藥方[19]。相關(guān)研究[20]表明，中藥復(fù)方對肺脾兩虛型特發(fā)性肺纖維化大鼠模型有顯著療效，其機(jī)制主要是通過影響白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子-α等炎性因子的表達(dá)，改善或延緩肺泡炎癥發(fā)展起到抑制炎癥及肺纖維化的作用。地龍可用于肺熱哮喘，可單用研末內(nèi)服，或配伍使用。入肺經(jīng)，又能清肺泄熱而平喘[15]。主要成分本品含蚯蚓解熱堿、蚯蚓素、蚯蚓毒素；尚含磷脂、膽固醇、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸及黃嘌呤、腺嘌呤、膽堿等成分。地龍?zhí)崛∥锏佚埖鞍讖V泛用于臨床，并越來越多地用于心腦血管、內(nèi)分泌、呼吸系統(tǒng)等疾病的預(yù)防和治療。通過本研究表明，對于A549細(xì)胞，與正常組比較，TGF-β1組圓形度和E-cad表達(dá)顯著降低，Collagen-Ⅰ表達(dá)顯著升高；與TGF-β1組比較，地龍組能顯著抑制E-cad表達(dá)的下調(diào)，地龍組能顯著抑制Collagen-Ⅰ表達(dá)的上調(diào)。對于MRC-5細(xì)胞，與正常組比較，TGF-β1組FN、Collagen-Ⅰ的分泌量顯著增加；與TGF-β1組比較，地龍組的上述兩種蛋白的分泌量顯著減少。因此，地龍?zhí)崛∥镆种芓GF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺成纖維細(xì)胞的活化，提示地龍?zhí)崛∥锟赡芫哂幸种品卫w維化的形成和發(fā)展的作用。