李東芹

摘要 [目的]建立蘿卜硫素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）快速測(cè)定方法。[方法]采用Acquity UPLC BEH Amide（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為含0.04%乙酸的乙腈與0.04%乙酸水溶液梯度洗脫12 min，流速為0.2 mL/min;在質(zhì)譜正離子模式下用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）模式來進(jìn)行定量測(cè)定。[結(jié)果]蘿卜硫素在9.7～310.0 μg/L線性關(guān)系良好（r=0.999 5），回收率為74.2%～124.2%，RSD為1.35%～7.19%;測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好，RSD為2.93%;方法的定量限為0.002 5 μg/L（S/N=10），檢出限為0.001 2 μg/L（S/N=5）。[結(jié)論]該方法靈敏度高、選擇性好，適用于蔬菜遺傳育種、營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值開發(fā)研究中蘿卜硫素的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;蘿卜硫素;西蘭花;花椰菜

Abstract [Objective]A rapid high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method was developed for the determination of sulforaphane in the vegetables.[Method]The HPLC separation was carried on the Acquity UPLC BEH Amide column （150 mm×2.1 mm，1.7 μm） with methanol and 0.1% acetum buffer eluting gradiently in 12 min.The total flow rate was 0.3 mL/min.The sulforaphane was detected by using multiple reaction monitoring （MRM） in ESI positive mode of mass spectrometer.[Result]There was a good linear relationship within the range of 9.7-310.0 μg/L（r=0.999 5）.The recovery rate was 74.2%-124.2%，the RSD was 1.35%-7.19%; the repeatability of the measurement results was good，the RSD was 2.93%.The limit of quantification of the method was 0.002 5 μg/L （S/N=10），and the limit of detection was 0.001 2 μg/L （S/N=5）.[Conclusion]This method has high sensitivity and good selectivity，and is suitable for rapid determination of sulforaphane in vegetable genetic breeding，nutrition and medicinal value development research.

Key words High performance liquid chromatography-mass spectrometry（ HPLC-MS/MS）; Sulforaphane; Broccoli;Cauliflower

蘿卜硫素的化學(xué)名稱為1-異硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷?，F(xiàn)有研究證明，它不僅對(duì)結(jié)腸癌、皮膚癌、乳腺癌等有明顯的阻斷作用[1-3]，還可以抑制甲型流感病毒復(fù)制[4]及保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[5]。因蘿卜硫素的化學(xué)合成需要大量有毒試劑且過程不可控，其主要來源還是從蔬菜中提取，所以建立蘿卜硫素的測(cè)定方法對(duì)其開發(fā)利用具有非常重要的意義。西蘭花、紫甘藍(lán)和花椰菜等十字花科的蔬菜中含有非常豐富的蘿卜硫素?，F(xiàn)有的蔬菜中蘿卜硫素的研究主要集中在酶解方法[6-7]、提取和純化工藝方面[8-14]，其定量分析方法研究的很少且主要為液相色譜方法[15-18]。隨著分析儀器的飛速發(fā)展，質(zhì)譜以其高靈敏度、高選擇性的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，如孔蘭等[19-20]用氣相色譜質(zhì)譜分析西蘭花中的揮發(fā)性組分，馬帥等[21]利用液相色譜質(zhì)譜分析西蘭花和花椰菜中23種酚酸類物質(zhì)。蜂蜜、花粉等物質(zhì)中蘿卜硫素的液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)有少量報(bào)道[22-25]，但其在蔬菜中的檢測(cè)應(yīng)用鮮見報(bào)道。該試驗(yàn)建立了蔬菜中蘿卜硫素的液相色譜質(zhì)譜分析方法，以期為蔬菜育種、營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值開發(fā)研究中蘿卜硫素的快速測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。4000 Qtrap 串聯(lián)三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）; LC-30AD高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;Milli-pore 超純水儀（美國(guó)Millipore公司）;超聲波（寧波新芝）;1/10 000天平（梅特勒公司）;蠕動(dòng)泵（Hamilton 公司）。

1.1.2 試劑。乙腈（色譜純，默克公司）;超純水;蘿卜硫素（≥98%，LC_MS級(jí)別，成都克洛瑪生物科技公司）;甲酸和乙酸（默克，色譜純）;1 mL醫(yī)用注射器（上海安普）;0.22 μm微孔濾頭（津騰，尼龍66進(jìn)口）。

1.1.3 試材。西蘭花、花椰菜均為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)市場(chǎng)采購(gòu)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備。

因?yàn)橘|(zhì)譜儀不能使用非揮發(fā)性酸及鹽類物質(zhì)，參考文獻(xiàn)[4]和[26]，對(duì)蘿卜硫素的提取方法進(jìn)行改良。將新鮮蔬菜切成2 mm左右的小塊，精確稱量1 g左右樣品（每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)）放置于50 mL的離心管，加入 5 mL 正己烷超聲5 min脫脂，重復(fù)操作2次后將正己烷揮發(fā)至干。加入5 mL pH為5左右的甲酸水溶液，超聲水解5 min。加入20 mL乙酸乙酯，超聲萃取30 min，加入過量的無水硫酸鈉干燥處理，以4 000 r/min離心5 min，取200 μL上清于1.5 mL離心管內(nèi)，通風(fēng)櫥內(nèi)室溫?fù)]發(fā)至干。提取物用1 000 μL 30%的乙腈水溶液復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm微孔濾頭過濾后上機(jī)測(cè)試。

1.2.2 儀器條件。

1.2.2.1 色譜條件。Acquity UPLC BEH Amide（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，樣品室溫度為室溫;流動(dòng)相：A為0.1%乙酸水溶液，B為含0.1%乙酸的乙腈溶液;流速為0.2 mL/min，柱溫箱溫度為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。梯度洗脫條件為：B∶A，0 min 為 5∶95（V/V），5 min 為 80∶50 （V/V），5.1 min為100∶0 （V/V），8.1 min為5∶95 （V/V），12 min程序結(jié)束。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件。采用電噴霧（ESI）離子源，在正離子電離模式下選用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式進(jìn)行定量分析。電噴霧電壓5 500 V;離子源溫度500 ℃;離子源輔助氣GS1/GS2氣流均為50 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

濃度155 μg/L的蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)溶液用蠕動(dòng)泵直接進(jìn)質(zhì)譜儀進(jìn)行Q1掃描，在ESI+ 電離模式下得到蘿卜硫素的[M+H]+為 178.2的母離子，ESI- 電離模式下蘿卜硫素的母離子176.2信號(hào)很弱，因此選用ESI+ 電離模式;再選用子離子掃描模式，一定碰撞能量下將母離子打碎，得到蘿卜硫素的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖1）;繼續(xù)對(duì)去簇電壓（DP）、入口電壓（EP）、碰撞能量（CE）和碰撞出口電壓（CXP）等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在DP為75 V、EP為8 V、CE為18 V、CXP為6 V 條件下，蘿卜硫素的母離子、子離子信號(hào)強(qiáng)度比例適中，靈敏度最高。選取豐度最大的子離子作為定量子離子對(duì)（178.2/114.1）、豐度次強(qiáng)的子離子作為參考離子對(duì)（178.2/119.3）進(jìn)行定量測(cè)定。

2.2 色譜分離條件優(yōu)化 用濃度為38.75 μg/L的蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)溶液，單因素試驗(yàn)比較島津VP-ODS C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）色譜柱和Acquity UPLC BEH Amide（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，甲醇-水和乙腈-水組合的分離效果，發(fā)現(xiàn)Acquity UPLC BEH Amide色譜柱峰型較好，乙腈-水體系洗脫信號(hào)強(qiáng)度較高;用Acquity UPLC BEH Amide色譜柱和乙腈-水體系，試驗(yàn)不同梯度洗脫程序，最終確定“1.2.2”的色譜分離條件。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

影響蔬菜中蘿卜硫素萃取效果的3個(gè)關(guān)鍵因素為水解時(shí)間、萃取試劑和萃取時(shí)間。該研究用單因素試驗(yàn)分別考察水解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、萃取試劑（二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮）和超聲萃取時(shí)間（15、30、45、60、75 min）對(duì)蘿卜硫素萃取率的影響，結(jié)果顯示，水解時(shí)間對(duì)萃取效率幾乎沒影響;二氯甲烷效果最好，丙酮最差，考慮到試劑的毒性和環(huán)境污染，選擇效果居中的乙酸乙酯作溶劑;超聲萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響是先隨時(shí)間增長(zhǎng)升高再緩慢下降（圖2），綜上選用“1.2.1”的樣品處理方法。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

精確稱取蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品6.2 mg，用30%的乙腈水溶液溶解定容至100 mL容量瓶，得到62 mg/L 的蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用30%乙腈水溶液逐步稀釋為310.00、155.00、77.50、38.75、19.40、9.70、0.97、0.49 μg/L 梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。在“1.2.2”儀器條件下上機(jī)分析。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)（x）、相應(yīng)的蘿卜硫素峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示（圖3），蘿卜硫素在9.7～310.0 μg/L線性關(guān)系良好，線性方程為y=1.6E+004x +1.11E+005 （r=0.999 9）。

2.4.2 方法的檢出限和定量限。將標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)稀釋后上機(jī)分析，以目標(biāo)峰信噪比（S/N）為10和5，確定方法的定量限和檢出限分別為0.002 5和 0.001 2 μg/L。

2.4.3 精密度試驗(yàn)。

將精確濃度為38.75 μg/L 的蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，檢測(cè)結(jié)果平均值為38.5 μg/L，RSD為2.93%。

2.4.4 回收率試驗(yàn)。

新鮮西蘭花中蘿卜硫素含量在1～6 μg/g，所以選擇1.55 、3.10、6.20 μg/g 濃度水平的添加。同樣條件下，蘿卜硫素的萃取率也會(huì)有一定波動(dòng)，因此在加標(biāo)回收試驗(yàn)同時(shí)做一份對(duì)照樣品。精確稱取1 g西蘭花的花蕾10份，分別添加1.55、3.10、6.20 μg 標(biāo)準(zhǔn)樣品（每個(gè)質(zhì)量水平3份），按“1.2.1”的方法前處理后上機(jī)分析。 經(jīng)計(jì)算（表1），蘿卜硫素3個(gè)質(zhì)量水平添加的回收率為74.2%～124.2%，RSD為1.35%～7.19%。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

分別精確稱取花椰菜的花和莖、西蘭花的花、莖、葉1 g左右（2個(gè)重復(fù)），經(jīng)“1.2.1”方法處理后，在“1.2.2”儀器條件下上機(jī)測(cè)試，由外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算，蘿卜硫素在新鮮花椰菜的花和莖中含量分別為2.2 和1.7 μg/g ，在西蘭花的花、莖、葉中的含量分別為5.8、3.2 和12.0 μg/g。這里西蘭花葉片中蘿卜硫素含量比花中高是因?yàn)槿~片的含水量非常低的緣故。

3 結(jié)論

該研究建立的蘿卜硫素液相色譜質(zhì)譜測(cè)定方法，前處理簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短，其高靈敏、高選擇性的特點(diǎn)能有效避免液相色譜法中雜質(zhì)干擾問題，可普遍適用于各種蔬菜中蘿卜硫素的快速測(cè)定，不僅可為蔬菜的育種研究、營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值開發(fā)研究提供技術(shù)支持，還可為人們?nèi)粘Ｉ攀碃I(yíng)養(yǎng)搭配和食療保健提供理論指導(dǎo)。

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