鄒 波，黃榆舒，李 璐，余元善，徐玉娟，吳繼軍，安可婧，陳漢民

（1.廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所/農業(yè)農村部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610；2.華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；3.廣東展翠食品股份有限公司，廣東 潮州 515634）

【研究意義】佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）為蕓香科香櫞屬植物的果實，是我國傳統(tǒng)中藥材，同時也是藥食兩用的水果，富含精油、黃酮等活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、燥濕化痰等功效［1-3］。佛手鮮食口感不佳，通常將其加工成中藥飲片或蜜餞、佛手膏、糖果等食品［4-5］。益生菌是一類能對宿主產生有益作用的微生物，可通過菌體本身及其代謝產物在胃腸道環(huán)境中發(fā)揮調節(jié)菌群平衡、抑制腐敗菌和致病菌生長等作用，促進人體健康［6］。近年來，益生菌發(fā)酵果蔬在我國發(fā)展迅速。將佛手進行益生菌發(fā)酵，不僅可以豐富佛手的產品形式，還能分解佛手中的生物大分子，促進人體吸收，而乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌耐熱性較差，在軟糖等產品加工過程中易失活?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌等芽孢桿菌安全性高且耐熱性較好，在加工過程中不易失活，耐受胃酸能力強于乳酸菌［7-9］。將佛手進行芽孢桿菌發(fā)酵，可為開發(fā)富含活菌的發(fā)酵佛手糖果等產品提供科學指導?！厩叭搜芯窟M展】現(xiàn)有佛手的研究主要集中在佛手精油成分分析［10］，微波干燥［11］、微波輔助熱風干燥［12］、微波與真空冷凍聯(lián)合干燥［13］等干燥技術對佛手加工品質的影響，低糖型佛手蜜餞的加工及產品開發(fā)［4］等方面，關于益生菌發(fā)酵佛手的研究鮮見報道。益生菌應用于果蔬發(fā)酵最早見于泡菜，乳酸菌是最早發(fā)現(xiàn)并應用于果蔬發(fā)酵的益生菌［6］，隨著人們對益生菌產品的認可，益生菌在荔枝、李、青梅等水果中的應用研究報道也在不斷增加［14］。盡管如此，益生菌發(fā)酵作用對果蔬中多酚、黃酮和抗氧化能力的影響機理尚不明確。方晟等［1］研究表明，金佛手自然發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基、羥基自由基、ABTS自由基等清除能力總體呈上升趨勢，發(fā)酵過程中乳酸等有機酸含量逐漸升高；陳永芳等［15］研究表明，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵可增加胡蘿卜汁中游離態(tài)多酚含量，減少結合態(tài)多酚含量，提升抗氧化活性。植物乳桿菌發(fā)酵則可降低桑椹中花色苷含量，同時降低抗氧化活性［16］。近年來，耐熱性、耐酸性較好的芽孢桿菌除應用于飼料研究外［7,9］，也逐漸應用到納豆［17-18］、枸杞［8］、陳皮［19］等果蔬及中藥材中?！颈狙芯壳腥朦c】從食用安全性和保健作用功效考慮，佛手是益生菌發(fā)酵的優(yōu)良植物資源，但現(xiàn)有研究僅見金佛手自然發(fā)酵的報道，接種益生菌（尤其是芽孢桿菌）發(fā)酵并研究其對佛手品質的影響還處于空白，以益生菌發(fā)酵的佛手為原料制備糖果的研究也未見報道?！緮M解決的關鍵問題】為實現(xiàn)佛手加工產品的多元化，開發(fā)富含活菌的益生菌發(fā)酵佛手糖果，本研究以佛手漿為研究對象，分別接種耐熱性較好的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌，研究其發(fā)酵過程中芽孢桿菌的生長曲線，糖組分、總酚、總黃酮含量及抗氧化能力的變化，探明芽孢桿菌發(fā)酵對佛手漿品質的影響，明確糖果的制作工藝是否會造成芽孢桿菌的大量死亡，為佛手高值化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料、菌種與試劑 佛手采摘于廣東省潮州市，清洗并自然晾干，分裝，密封，置于-20℃凍藏；枯草芽孢桿菌（BS168，模式菌株，BGSCID 1A1）、地衣芽孢桿菌（BL02，CCTCC M208065）和凝結芽孢桿菌（BC30，ATCC PTA-6086）均為實驗室保存；Folin-Ciocalteu 試劑，沒食子酸和蘆丁標準品，上海源葉生物科技有限公司；Trolox，Sigma-Aldrich 公司；LB 肉湯和固體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙腈（HPLC），美國Tedia 公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器設備 PBJ-G16K 破壁料理機，德國貝爾斯頓公司；UV-1800 型分光光度計，日本島津公司；PB-10 型pH 計，賽多利斯公司；PX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；無菌操作臺，蘇凈集團蘇州安康空氣技術有限公司；Biofuge Stratos Sorvall 型臺式高速冷凍離心機，Thermo Fisher Scientific 公司；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；LC-20A 高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化與準備 將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌分別接種至LB 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床120 r/min 培養(yǎng)至OD600=4，即可作為種子液，發(fā)酵前將種子液離心，沉淀用生理鹽水重懸后使用。

1.2.2 發(fā)酵佛手漿制備與分組 冷凍佛手（0.5 kg）室溫自然解凍，置于破壁料理機中，加入4 倍質量純水打漿，然后添加10 g/kg 葡萄糖，100℃滅菌2 min 后于超凈工作臺分裝至三角瓶。待自然冷卻后，加入1%活化后的菌種重懸液，混勻，37℃搖床120 r/min 發(fā)酵48 h，分別于0、12、24、36、48 h 取樣，用于各項指標測定?？莶菅挎邨U菌168 發(fā)酵佛手漿、地衣芽孢桿菌02 發(fā)酵佛手漿和凝結芽孢桿菌30 發(fā)酵佛手漿分別記為BS168、BL02 和BC30。

1.2.3 發(fā)酵佛手漿軟糖的制備 發(fā)酵佛手漿軟糖配方為麥芽糖漿15%、蔗糖15%、濃度為30%（M/V）的明膠溶液50%、發(fā)酵佛手漿20%。凝膠軟糖的制備：將等質量的麥芽糖漿和蔗糖加熱溶解，降溫至70℃，加入預熱至70℃的明膠溶液攪拌均勻，再加入發(fā)酵后的佛手漿，混合均勻后倒入磨具中，冷卻成型。取成型后的凝膠軟糖，用于芽孢桿菌的測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 芽孢桿菌測定 將樣品用生理鹽水稀釋至不同梯度，最高稀釋倍數(shù)為10-7，取稀釋后的樣品1 mL，加入LB 固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，記錄菌落數(shù)。

1.3.2 pH 值測定 佛手漿的pH 采用pH 計直接測定。

1.3.3 糖組分測定 取不同發(fā)酵階段的佛手漿10 g，加入10 mL 水，在45℃水浴中加熱1 h，補足揮發(fā)的水分，5000 r/min 離心5 min，收集上清液。糖組分含量的測定采用HPLC 法［20］。

1.3.4 總酚、黃酮含量測定 取不同發(fā)酵階段的佛手漿10 g，加入到20 mL 提取液（甲醇∶鹽酸=99 ∶1）30℃超聲處理10 min，5000 r/min 離心5 min，收集上清液，沉淀繼續(xù)提取2 次，合并提取液，定容至50 mL，用于總酚和總黃酮含量的測定。其中，總酚含量采用Folin Ciocalteu 法［21］測定，以沒食子酸為標準對照品，繪制標準曲線，佛手漿總酚含量以每千克佛手漿中沒食子酸當量（mg）表示；總黃酮含量采用鋁離子法［22］測定，以蘆丁為標準對照品，繪制標準曲線，佛手漿總黃酮含量以mg/L 表示。

1.3.5 清除DPPH 自由基能力測定 參照Zou等［23］方法，取稀釋后的樣品50 μL，加入150 μL DPPH 溶液（0.2 mmol/L），混勻后在室溫條件下避光反應20 min，用酶標儀測定517 nm 處吸光度，以Trolox 為標準對照品，以濃度為橫坐標、DPPH自由基清除率為縱坐標，繪制標準曲線，設試劑空白對照（無水乙醇）、對照（以等體積甲醇代替樣品）、樣品空白對照（以等體積無水乙醇代替DPPH 溶液），3 次重復。DPPH 自由基清除率按下式計算：

式中，A1為對照吸光度，A0為試劑空白對照吸光度，Ai為樣品吸光度，Aj為樣品空白對照吸光度。樣品對DPPH 自由基清除能力以每千克佛手漿中Trolox（mg）當量表示。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel、Origin 8.5、SPSS 17 進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 佛手漿發(fā)酵過程中芽孢桿菌的生長規(guī)律

取滅菌后的佛手漿，檢測菌落總數(shù)、霉菌和酵母，培養(yǎng)基上未觀察到菌落數(shù)，確認佛手漿接種前處于無菌狀態(tài)。對滅菌后的佛手漿接入枯草芽孢桿菌（BS168）、地衣芽孢桿菌（BL02）和凝結芽孢桿菌（BC30），相應生長曲線如圖1 所示，隨著發(fā)酵時間的延長，3 種芽孢桿菌數(shù)量均呈現(xiàn)上升趨勢，12 h 進入生長對數(shù)期，36 h 生長速率減慢，進入穩(wěn)定期。3 種芽孢桿菌以BC30 生長速度最快，發(fā)酵48 h 后活菌數(shù)達8.35 log CFU/g；BS168 和BL02 的生長速率基本一致。由此可見，3 株芽孢桿菌中，BC30 對佛手漿的適應能力最強。

2.2 佛手漿發(fā)酵過程中糖組分和pH 值的變化

佛手漿中糖組分色譜圖見圖2，除外源添加的葡萄糖外，佛手漿中的糖主要以果糖為主，其次是蔗糖，相較之下其他糖組分含量很少。佛手漿中接入芽孢桿菌后，隨著發(fā)酵時間的延長，果糖、葡萄糖和蔗糖含量均呈現(xiàn)下降趨勢，其中發(fā)酵0～36 h 糖含量下降較緩慢，發(fā)酵36～48 h 糖含量下降較快（圖3），發(fā)酵過程中糖含量與芽孢桿菌活菌數(shù)呈反比，這可能是芽孢桿菌在發(fā)酵過程中逐漸消耗糖所致。BC30 對糖的消耗速率略快于其他兩種芽孢桿菌，發(fā)酵48 h，BC30 組果糖、葡萄糖和蔗糖含量分別下降21.6%、23.0%、23.1%。以上結果表明，與枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌相比，凝結芽孢桿菌能較好地利用佛手漿中的糖。

圖1 佛手漿發(fā)酵過程中芽孢桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus during the fermentation of fingered citron pulp

圖2 果糖、葡萄糖、蔗糖標準品（A）及佛手漿中糖組分（B）色譜圖Fig.2 Chromatogram of standards of fructose,glucose and sucrose（A）,and sugar composition of fingered citron pulp（B）

圖3 佛手漿發(fā)酵過程中糖組分的變化Fig.3 Changes of sugar compositions during the fermentation of fingered citron pulp

由圖4 可知，佛手漿發(fā)酵過程中pH 值呈逐漸下降趨勢，但整體變化不大，其中BC30 處理pH 值下降略快，發(fā)酵48 h 其pH 值從初始的5.32下降至5.20。有研究報道稱，凝結芽孢桿菌可分解糖類生成L-乳酸，為同型乳酸發(fā)酵菌［8］。本研究發(fā)現(xiàn)佛手漿pH 值與凝結芽孢桿菌活菌數(shù)呈負相關，與葡萄糖、果糖和蔗糖含量呈正相關，推測pH 值的下降可能與凝結芽孢桿菌利用糖產生乳酸有關。

圖4 佛手漿發(fā)酵過程中pH 值的變化Fig.4 Changes of pH value during the fermentation of fingered citron pulp

2.3 佛手漿發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的變化

佛手漿發(fā)酵過程中總酚含量的變化如圖5 所示，BC30 發(fā)酵過程中，佛手漿總酚含量先輕微升高，隨后逐漸下降；BS168 和BL02 發(fā)酵的佛手漿，總酚含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。發(fā)酵48 h 后，佛手漿總酚含量從大到小依次為BC30、BL20、BS168 處理，與發(fā)酵前相比，總酚保留率分別為91.0%、87.4%、75.9%。

圖5 佛手漿發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.5 Changes of total phenolics contents during the fermentation of fingered citron pulp

從圖6 可以看出，BC30 發(fā)酵過程中，佛手漿總黃酮含量先迅速升高，然后逐漸下降，發(fā)酵36～48 h 時保持平衡。BL02 發(fā)酵過程中，佛手漿總黃酮含量呈現(xiàn)先下降后上升、再輕微下降的趨勢；BS168 發(fā)酵過程中，佛手漿總黃酮含量逐漸下降，發(fā)酵36 h 時略微升高，隨后又呈現(xiàn)下降趨勢，但發(fā)酵24～48 h 總黃酮含量變化幅度較小。發(fā)酵48 h 后，佛手漿總黃酮含量從大到小依次為BC30、BL20、BS168 處理，與發(fā)酵前佛手漿相比，BC30 處理總黃酮含量升高4.4%。

圖6 佛手漿發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化Fig.6 Changes of total flavonoids content during the fermentation of fingered citron pulp

BC30 發(fā)酵12 h 佛手漿總酚和總黃酮含量升高，可能與凝結芽孢桿菌的生命活動及黃酮、蛋白質、精油等化合物的結構變化有關。凝結芽孢桿菌在發(fā)酵過程中可產生蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶等酶［8,19］，降解佛手中的蛋白質、果膠等，生成氨基酸等小分子化合物，并釋放被包埋多酚、黃酮，導致總酚和總黃酮的含量升高［15］。多酚、黃酮自身并不穩(wěn)定，隨著發(fā)酵時間的延長會逐漸下降，當下降速度快于被釋放速度時，表現(xiàn)為下降趨勢。此外，還原糖含量的下降也會導致總酚含量下降。后續(xù)將進行佛手漿中多酚、黃酮等化合物單體的檢測，以明確單一多酚、黃酮含量變化。

2.4 佛手漿發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化

本研究以清除DPPH 自由基能力測定佛手漿發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化，結果見圖7，BC30 發(fā)酵的佛手漿抗氧化能力逐漸升高，發(fā)酵至36 h 抗氧化能力最高；BS168 和BL02 發(fā)酵的佛手漿抗氧化能力在12 h 最低，之后隨著發(fā)酵時間的延長逐漸升高，發(fā)酵48 h 達到最高。在整個發(fā)酵過程中，BC30 發(fā)酵的佛手漿抗氧化能力最強，其次為BL02，BC30 發(fā)酵48 h 佛手漿的抗氧化能力是BS168 的1.08 倍。

2.5 凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中佛手漿理化指標之間的相關性分析

圖7 佛手漿發(fā)酵過程中清除DPPH 自由基能力的變化Fig.7 Changes of scavenging ability of DPPH free radical during the fermentation of fingered citron pulp

從上述分析可以看出，3 種芽孢桿菌以BC30最適宜在佛手漿中生長，且BC30 發(fā)酵能提升佛手漿的抗氧化能力，因此本文對凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中佛手漿的抗氧化能力、活菌數(shù)、總酚含量、總黃酮含量、果糖含量、葡萄糖含量、蔗糖含量和pH 值進行Pearson 相關分析，結果見表1。表1 顯示，佛手漿清除DPPH 自由基能力與活菌數(shù)呈極顯著正相關，與pH 值呈極顯著負相關，與總酚、總黃酮含量無顯著相關性；活菌數(shù)與總酚、果糖含量呈顯著負相關，表明發(fā)酵過程中凝結芽孢桿菌可提升佛手漿清除DPPH 自由基能力，同時也會造成部分酚類物質的損失。

凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中，佛手漿清除DPPH 自由基能力的變化與總酚、總黃酮含量的變化無顯著相關性，這可能與佛手漿中黃酮類化合物的結構變化有關。研究顯示，凝結芽孢桿菌發(fā)酵可提高陳皮發(fā)酵液中總酚、總黃酮含量和抗氧化能力，降低發(fā)酵殘渣中總酚、總黃酮含量和抗氧化能力，表明發(fā)酵有利于抗氧化物質從陳皮釋放到發(fā)酵液中［19］。本研究中，凝結芽孢桿菌發(fā)酵可能導致佛手中抗氧化物質的釋放，將香葉木素糖苷類化合物、橙皮苷等化合物降解成香葉木素、橙皮素等抗氧化能力更強的化合物［3］，導致發(fā)酵后的佛手漿抗氧化能力提高。后續(xù)將檢測佛手漿中多酚、黃酮等化合物單體含量，進一步探明單一多酚和黃酮含量變化及其對佛手抗氧化能力的貢獻。

表1 凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中佛手漿理化指標之間的相關性分析Table 1 Correlation analysis of physicochemical indexes of finger citron pulp during the fermentation by Bacillus coagulans

2.6 凝結芽孢桿菌在軟糖中的存活率

以凝結芽孢桿菌發(fā)酵的佛手漿為原料，制備益生菌軟糖，結果發(fā)現(xiàn)，軟糖中BC30 活菌數(shù)為7.5 log CFU/g，高于《食品安全國家標準 發(fā)酵乳》（GB 19302-2010）規(guī)定的乳酸菌活菌數(shù)大于6.0 log CFU/g。該凝膠軟糖有佛手的清香味，但也存在一定的苦味，開發(fā)出口感適宜且富含活菌的軟糖還有待進一步研究。

3 討論

目前，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌因其具有綠色無污染、無毒無害、可部分替代抗生素等優(yōu)異生物學特性，廣泛應用于飼料、食品及醫(yī)藥領域［9,24］?，F(xiàn)有研究主要集中于芽孢桿菌在發(fā)酵飼料中的應用，近年來研究發(fā)現(xiàn)，在我國傳統(tǒng)白酒、泡菜、陳醋等釀造業(yè)中也有芽孢桿菌存在。Yang 等［25］從四川泡菜中分離出一株枯草芽孢桿菌，將其接種至泡菜中進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其可加速泡菜pH 的下降，促進乳酸桿菌和乳球菌等乳酸菌的生長，抑制致病菌生長，且芳樟醇、γ-松油烯、乳酸、草酸和大部分氨基酸含量均顯著高于自然發(fā)酵的泡菜。劉桂君等［26］從牛欄山酒廠生產用大曲中分離純化得到地衣芽孢桿菌，將其添加到酒醅中可顯著提高白酒乙酸乙酯含量，增加酒體協(xié)調感，提高白酒品質。楊帆等［27］從茅臺酒生產用大曲中分離純化得到2株地衣芽孢桿菌和1 株枯草芽孢桿菌，在白酒發(fā)酵過程中可產生二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、苯乙酸、呋喃扭爾、丁二醇、丁烯酸和異戊酸等醬香型酒類風味物質，對茅臺酒風味的呈現(xiàn)有重要作用。

本研究首次將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌應用到佛手漿發(fā)酵中，明確了不同芽孢桿菌單獨發(fā)酵過程中活菌數(shù)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)3 種芽孢桿菌均能較好生長，其中凝結芽孢桿菌BC30 生長最好、活菌數(shù)最高，且能增加佛手漿的酸度。采用凝結芽孢桿菌對枸杞汁進行發(fā)酵［8］，活菌數(shù)可達2.1×108CFU/mL，口感和風味得到較大提升。將凝結芽孢桿菌與副干酪乳桿菌、植物乳桿菌和雙歧桿菌等益生菌接種到紅棗牛奶中進行發(fā)酵［28］，4 ℃貯藏20 d 后活菌數(shù)仍可達1.14×108CFU/mL，這與本研究結果相似。

隨著發(fā)酵時間的延長，凝結芽孢桿菌發(fā)酵的佛手漿清除DPPH 自由基能力呈上升趨勢，該變化可能與佛手漿中還原糖、總酚、總黃酮含量相關。然而，本研究相關性分析結果顯示，凝結芽孢桿菌發(fā)酵過程中佛手漿抗氧化能力與總酚、總黃酮含量無顯著相關性，但與活菌數(shù)呈極顯著正相關，表明佛手漿清除自由基能力可能受凝結芽孢桿菌代謝產物的影響。在楊梅［29］、針葉櫻桃和番石榴果實［30］益生菌發(fā)酵中也得到類似的研究結果。本研究發(fā)現(xiàn)，將發(fā)酵后的佛手漿應用到軟糖中，益生菌數(shù)量仍可達7.5 log CFU/g，這為開發(fā)益生菌軟糖提供了理論依據(jù)。后續(xù)將進一步研究佛手漿發(fā)酵過程中黃酮單體的結構變化及糖果制作工藝，以闡明芽孢桿菌對黃酮類化合物結構的影響，并開發(fā)出口感適宜的益生菌糖果。

4 結論

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌均能在佛手漿中存活，其中凝結芽孢桿菌BC30生長較好，發(fā)酵48 h 活菌數(shù)可達8.35 log CFU/g。3 種芽孢桿菌發(fā)酵的佛手漿總酚含量呈整體下降趨勢，發(fā)酵48 h 后BC30 的總酚保留率最高（達91.0%）、總黃酮含量及清除DPPH 自由基能力最高。相關性分析顯示，BC30 發(fā)酵過程中佛手漿的抗氧化能力與活菌數(shù)呈顯著正相關，以其為原料開發(fā)的軟糖活菌數(shù)可達7.5 log CFU/g。