王 維 郭 欣
金錢白花蛇來源于眼鏡蛇科動物銀環(huán)蛇(Bungarus multicinctus Blyth)的幼蛇干燥體,具有祛風、通絡、止痙的功效,臨床用于治療風濕頑痹,麻木拘攣,中風口眼?斜,半身不遂,抽搐痙攣,破傷風,麻風等病癥[1]。其含有蛋白質、脂肪、氨基酸、糖類,以及鈣、磷、鐵、鋅等20 多種元素[2]。藥理研究顯示,金錢白花蛇具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤作用[3]。目前,蛋白質常用化學測定手段主要有微量凱氏定氮法[4],雙縮脲試劑反應[5],Folin-酚法(Lowry)[6]等。Folin-酚試劑是蛋白質含量測定最靈敏的方法之一,其原理是在堿性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅離子結合生成復合物,Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基還原,產生深藍色(鉬蘭和鎢蘭的混合物),藍色深度與蛋白的量成正相關[7]。此法操作簡單迅速不需特殊的儀器設備,且靈敏度高,15min 就有最大的顯色并可穩(wěn)定數小時。因此,本研究采用Folin-酚試劑法測定金錢白花蛇粉末中蛋白質含量,以期為金錢白花蛇粉末中蛋白質提取、分離、藥理活性等方面的深入研究奠定基礎。
1.1 儀器 UV-2600 紫外分光光度計(島津公司)、HWS26-電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)、電子分析天平(瑞士梅特勒)。
1.2 試劑 牛血清白蛋白(中國食品藥品檢定研究院,供含量測定用,批號20190327)、氫氧化鈉(天津市光復科技發(fā)展有限公司,批號970522)、鎢酸鈉(京華化工廠,批號970512)、鉬酸鈉(北京化學試劑公司,批號950912)、無水碳酸鈉(北京化工廠,批號20150728)、蒸餾水(MILL-Q 純水儀制備),其他試劑均為分析純,購于北京化工廠。二甲基亞砜(DMSO,購自Solarbio)。
1.3 試驗樣品 不同批次的蘄蛇樣品購買自浙江省金華市磐安藥材城。分別編號標記為樣品1(批號20190705),樣品 2(SZ -20180213),樣品 3(20190804),樣品4(20180925)。經鑒定為眼鏡蛇科動物銀環(huán)蛇(Bungarus multicinctus Blyth)的幼蛇干燥體。不同批次樣品分別粉碎成細粉,過篩,混合均勻,備用。
2.1 溶液制備
2.1.1 配制Folin-酚試劑A 所需溶液制備 0.8%氫氧化鈉溶液制備:精密稱取氫氧化鈉0.8g 于100mL量瓶中,加水溶解并定容至刻度,搖勻,得0.8%氫氧化鈉溶液。4%無水碳酸鈉溶液的制備:精密稱取無水碳酸鈉4.0g 于100mL 量瓶中,加水溶解并定容至刻度,搖勻,得4%氫氧化鈉溶液。2%酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)溶液的制備:精密稱取酒石酸鉀鈉2.0g 于100mL 量瓶中,加水溶解并定容至刻度,搖勻,得2%酒石酸鉀鈉溶液。1%硫酸銅(CuSO4)溶液的制備:精密稱取無水硫酸銅1g 于100mL 量瓶中,加水溶解并定容至刻度,搖勻,得1%硫酸銅溶液。
2.1.2 Folin-酚試劑A(1)4%無水碳酸鈉溶液25mL,0.8%氫氧化鈉溶液25mL,等體積混合。(2)2%酒石酸鉀鈉溶液0.5mL,1%硫酸銅溶液0.5mL,等體積混合。臨用時,將(1)與(2)按體積比50:1 比例混合均勻,即得。
2.1.3 Folin-酚試劑B 將鎢酸鈉(H4Na2O6W)100g,鉬酸鈉(Na2MoO4.2H2O)25g,水700mL,85%磷酸50mL,濃鹽酸100mL,置1500mL 磨口圓底燒瓶中,充分溶解,混勻,裝上磨口冷凝管,回流10h。然后,分別加入硫酸鋰150g,水50mL 及溴液數滴,開口煮15min,去除過量的溴,冷卻后稀釋至1000mL,濾過(呈微綠色)貯于棕色瓶中,臨用前用氫氧化鈉滴定液(1mol/L)滴定,酚酞作指示劑(由于試劑量微綠色,影響滴定終點觀察,可將試液稀釋100 倍再滴定),根據滴定結果,用水將試劑稀釋到相當于1mol/L 的酸度(稀釋1 倍左右)。
2.1.4 對照品溶液制備 取牛血清白蛋白對照品約21.4mg,精密稱定,置25mL 容量瓶中,加0.1mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得濃度為0.856mg/mL 牛血清白蛋白儲備液。精密吸取3mL,置于25mL 容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得濃度為0.103mg/mL 對照品溶液。
2.1.5 供試品溶液的制備 稱取金錢白花蛇粉末約0.5g,置于100mL 量瓶中,加水適量使溶解,再加水定容至刻度,搖勻,精密吸取5mL,置于50mL 容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,即得。
2.2 Folin-酚試劑法 精密吸取系列牛血清白蛋白標準溶液,供試品溶液(0.9mL)加水至1.6mL,選取純凈水(3.2mL)作為隨行空白。分別置于具塞試管中,精密加入Folin-酚試劑A 4.0mL(空白加入8.0mL),搖勻,室溫放置10min,再分別精密加入Folin-酚試劑B 0.4mL(空白加入0.8mL),搖勻,密塞,在30℃水浴中保溫30min,恢復至室溫,采用紫外分光光度計在660nm 波長下測定吸光度。
2.3 MTT 法測定肝癌細胞抑制率 肝癌SMMC7721細胞經體外培養(yǎng)后,以1.5×104/孔接種于96 孔板上,培養(yǎng)24h 到細胞貼壁后,將金錢白花蛇蛋白類提取物質稀釋至終濃度為15mg/L(低劑量組)、30mg/L(中劑量組)、45mg/L(高劑量組)培養(yǎng)24h,對照組給予生理鹽水30mg/L,在每個孔中加入MTT 各20μL 繼續(xù)培養(yǎng)4h,停止培養(yǎng)后將培養(yǎng)基除去,每孔加入DMSO150μL,混合均勻,放置室溫下10min。以酶標儀于490nm 測定光密度值(OD 值),細胞抑制率=(1-實驗組OD 值/對照組OD 值)×100%。
3.1 線性關系 分別準確吸取2.1.4 項下牛血清白蛋白標準儲備液0.0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和1.6mL,置于具塞試管中,各管加水至1.6mL,再分別精密加Folin-酚試劑A 4.0mL,搖勻,室溫放置10min,再分別精密加入Folin-酚試劑B 0.4mL,搖勻,密塞,在30℃水浴中保溫30min,放冷,在660nm 波長處測定吸光度,以蛋白質含量為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,并進行線性回歸,結果見圖1。
圖1 牛血清白蛋白標準曲線
3.2 精密度實驗 精密吸取對照品溶液2mL,重復測定吸光度6 次,RSD 為0.012%,表明儀器精密度良好。見表1。
3.3 穩(wěn)定性實驗 精密吸取供試品溶液(樣品2)2mL,分別放置0、1、1.5、2、2.5、3h 測定吸光度,供試品溶液在0~3h 內穩(wěn)定性良好,RSD 值為1.550%。見表2。
3.4 重復性實驗 分別稱取金錢白花蛇粉末6 份,每份各取約0.5g,置于100mL 量瓶中,加水適量使溶解,再加水定容至刻度,搖勻,精密吸取5mL,置于50mL 容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,6 份樣品RSD 為0.709%,表明實驗重復性良好。見表3。
表1 精密度實驗結果
表2 樣品穩(wěn)定性實驗結果
表3 重復性實驗結果
表4 加樣回收實驗結果
3.5 加樣回收試驗 分別稱取金錢白花蛇粉末6份,每份各約0.5g,分別向其中加入77.20mg 牛血清白蛋白對照品,置于100mL 量瓶中,加水適量使溶解,再加水定容至刻度,搖勻,精密吸取5mL,置于50mL 容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,精密吸取供試品溶液0.7mL,加水至1.6mL,分別置于具塞試管中,精密加入Folin-酚試劑A 4.0mL,搖勻,室溫放置10min,再分別精密加入Folin-酚試劑B 0.4mL,搖勻,密塞,在30℃水浴中保溫30min,恢復至室溫,采用紫外分光光度計在660nm 波長下測定吸光度,計算蛋白質含量,結果顯示,蛋白質平均回收率為99.477%,RSD=0.873%。見表4。
3.6 樣品含量測定 分別準確稱量樣品各約0.5g,按照上述樣品測定方法進行制備并測定蛋白質含量。各樣品蛋白質含量由高到低依次為樣品2(173.380mg/g)、樣品4(170.810mg/g)、樣品1(153.390mg/g)、樣品3(126.470mg/g)。見表5。
3.7 對肝癌SMMU7721 細胞增殖的影響 與對照組相比較,白花蛇蛋白各個劑量組肝癌SMMU7721細胞增殖抑制率均大于對照組,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。其抑制率隨著濃度升高而逐漸增加,高劑量組抑制率達到67.821%。表明金錢白花蛇蛋白類物質對肝癌細胞有顯著抑制作用。見表6。
表5 金錢白花蛇粉末中蛋白質含量測定結果(mg/g)
表6 MTT 法檢測白花蛇蛋白對肝癌細胞增殖抑制率比較
本研究采用Folin-酚試劑法測定金錢白花蛇粉末中蛋白質含量。已有研究利用Folin-酚試劑法測定蛋白質總量,并證實該方法可靠、準確度高,且操作簡便[8-10]。石森林和王黎霞[11]很早就采用Folin-酚試劑法測定蘄蛇中蛇毒的蛋白含量,該方法回收率能達到98.00%以上,RSD 為1.76%,且簡便、穩(wěn)定、重現性好。研究顯示,蛇類所含的蛋白質成分有抑制類風濕關節(jié)炎細胞增殖和誘導凋亡作用[12]。通過調節(jié)P53 和P21 蛋白表達起到抗腫瘤作用等[13]。
本研究結果顯示,已建立的蛋白質含量測定方法具有操作簡便,靈敏度高,結果準確可靠等特點,適用于中藥金錢白花蛇中蛋白質含量的測定。金錢白花蛇作為傳統的中藥,以鮮藥組方入藥用于原發(fā)性肝癌的治療,但是其抗腫瘤機制尚不清楚。本研究結合所建立方法為金錢白花蛇蛋白質的質量控制、藥效評價、藥理活性篩查等后續(xù)深入研究奠定了基礎。同時本研究初步研究了金錢白花蛇蛋白類提取物質對肝癌SMMU7721 細胞增殖抑制的作用。結果顯示,隨著蛋白給藥劑量增加,其抑制率逐漸增強,提示金錢白花蛇蛋白類活性物質可能與其抗腫瘤存在一定的關系。