哈再古麗·賈漢 阿依恒·曲庫爾汗 馮娟 阿不都許庫爾·吾買爾

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，新疆 烏魯木齊 830028)

老年性聽力損傷(Age-Related Hearing Loss, AHL)是一類由遺傳、免疫、炎癥等多種因素共同參與產(chǎn)生的老年感知性疾病[1-2]，病情呈緩慢性加重，嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量。多種microRNAs(miRNAs)可在轉(zhuǎn)錄后水平通過調(diào)控基因沉默復(fù)合體(RNA-Induced Silencing Complex, RISC)來影響聽覺相關(guān)分子的表達(dá)[3]，從而參與AHL疾病的發(fā)生與進(jìn)展[4-5]，其中大量數(shù)據(jù)證實(shí)miR-34a可以通過miR-34a/SIRT1/p53、miR-34a/Bcl-2等信號通路來介導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞凋亡[6-7]，并能夠作為潛在的AHL治療靶點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。另外，最新研究通過篩查AHL模型小鼠發(fā)現(xiàn)Sestrin 2(SESN2)表達(dá)顯著降低[8]，且進(jìn)一步生物信息學(xué)分析提示SESN2的3′非翻譯區(qū)(3′ UTR)存在與miR-34a的靶向結(jié)合位點(diǎn)[9-10]。然而，關(guān)于miR-34a與SESN2在AHL發(fā)生、發(fā)展中的相互作用關(guān)系及機(jī)制報(bào)道鮮少，因此本研究旨在通過探討兩者在耳蝸毛細(xì)胞增殖及凋亡中的作用機(jī)制，為靶向miR-34a治療AHL提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基、PBS及0.25%胰蛋白酶溶液等購自美國Hyclone公司；Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購自德國QIAGEN公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)、CCK-8試劑盒(Abmole)、TRIzol、RT-PCR試劑及Power Up SYBR Green Kit等均購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GSH-Px)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)ELISA檢測試劑盒等購自南京建成生物工程研究所；WB檢測抗體均購自Abcam; 雙螢光素酶報(bào)告載體pGL3購自美國Promega公司，相應(yīng)pGL3-PIK3CA-SESN2-WT及突變型報(bào)告載體pGL3-PIK3CA-SESN2-Mut、SESN2過表達(dá)載體及同型陰性對照載體(Negative Control, NC)、miR-34a mimic及miR-34a無序?qū)φ瘴?NC mimic)等均由上海吉瑪生物公司設(shè)計(jì)合成，PCR檢測引物見表1。

表1 引物序列

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 HEI-OC1細(xì)胞分組培養(yǎng)于24孔板中，組別設(shè)置為轉(zhuǎn)染SESN2同型陰性對照組(NC組)、轉(zhuǎn)染SESN2過表達(dá)載體組(SESN2組)、共轉(zhuǎn)染SESN2過表達(dá)載體及miR-34a mimic組(SESN2+miR-34a mimic組)。待板中細(xì)胞密度至50%后參照Effectene Transfection Reagent說明書分別轉(zhuǎn)染不同載體質(zhì)粒，常規(guī)培養(yǎng)48 h后換液收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)測序驗(yàn)證后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.3 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 根據(jù)TargetScan(http: //www.targetscan.org)預(yù)測的miR-34a與SESN2(NM0314593)靶向結(jié)合位點(diǎn)，克隆含miR-34a潛在結(jié)合位點(diǎn)的SESN2 3′UTR區(qū)的野生型pGL3-PIK3CA-SESN2-WT載體，擴(kuò)增序列引物上游：5′-AT TGCCAAACCTCTGACTGCCA-3′，下游：5′-AATC GGATTCGGACTTCGGC-3′，定點(diǎn)突變核心序列“ACCTCT”后擴(kuò)增得到突變型pGL3-PIK3CA-SESN2-Mut載體。分別將上述載體與miR-34a mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并用pRL-TK空載體轉(zhuǎn)染空白細(xì)胞做陰性對照，48 h后根據(jù)Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒說明書測定各組細(xì)胞相對螢光素酶活性。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力 96孔板中接種各組細(xì)胞，每組6個平行對照，參照Cell Counting Kit說明書于穩(wěn)定培養(yǎng)24、48、72 h后加入10 mL CCK-8試劑，賦予4 h。檢測各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度(OD值)，計(jì)算分析各組細(xì)胞的增殖活性。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×105/mL，參照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒說明書加入500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞后，避光依次加入5 μl的Annexin V染色液和10 μl PI染液，同時配置空白細(xì)胞樣品、單染Annexin V和單染PI樣品用于調(diào)節(jié)光路補(bǔ)償，染色15 min后上流式細(xì)胞儀檢測并計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.6 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 消化收集上述3組細(xì)胞，PBS漂洗1次，采用超聲破碎儀裂解細(xì)胞，3000 r/min低速離心15 min，收集細(xì)胞裂解上清，參照SOD、CAT、GSH-Px、MDA試劑盒說明書檢測miR-34a與SESN2各組細(xì)胞內(nèi)氧化損傷相關(guān)分子的表達(dá)影響。

1.7 Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞加入含1%PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解細(xì)胞，并提取細(xì)胞蛋白，定量檢測后取等量蛋白行10% SDS-PAGE凝膠電泳，100 V恒壓電泳120 min; 電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移于活化的PVDF膜上，常規(guī)抗體孵育后滴加發(fā)光液曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采集發(fā)光圖像分析相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.8 qRT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平 參照TRIzol說明書裂解提取細(xì)胞總RNAs，逆轉(zhuǎn)合成cDNAs，標(biāo)定各組樣本cDNAs濃度后參照Power Up SYBR Green Kit說明書定量檢測目的基因表達(dá)量。GADPH、U6擴(kuò)增引物分別作為mRNA和miRNA的參比基因，每組細(xì)胞樣本設(shè)置3個平行對照，以采集到熒光信號均值(Ct值)計(jì)算2-△△Ct表示目的基因的相對表達(dá)量。同時做陰性對照用以排除反應(yīng)體系內(nèi)PCR污染及引物二聚體干擾。

2 結(jié)果

2.1 miR-34a靶向調(diào)控SESN2表達(dá) 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-34a能夠靶向抑制SESN2表達(dá)(圖1A)；WB及qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-34a能夠顯著抑制HEI-OC1細(xì)胞中SESN2的表達(dá)(圖1B)，而過表達(dá)SESN2能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)miR-34a的表達(dá)量(圖1C)。

圖1 miR-34a與SESN2靶向結(jié)合并相互作用

2.2 miR-34a靶向調(diào)控SESN2表達(dá)參與影響HEI-OC1細(xì)胞增殖 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)SESN2能夠顯著促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞增殖活力，與NC組細(xì)胞相比，48 h后SESN2組細(xì)胞增值活力顯著升高(P<0.001)，SESN2+miR-34a mimic組細(xì)胞的增殖活力無明顯變化(P>0.05)；而與SESN2組細(xì)胞相比，SESN2+ miR-34a mimic組細(xì)胞的增殖活力在48 h后明顯降低(P<0.05)，見圖2。

2.3 miR-34a靶向調(diào)控SESN2參與影響HEI-OC1細(xì)胞凋亡 與NC組HEI-OC1細(xì)胞相比，SESN2組細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞中促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)均明顯降低，但凋亡抑制蛋白Bcl-2及AMPK信號通路相關(guān)蛋白AMPK磷酸化水平及SIRT1表達(dá)水平明顯增加(均P<0.05)，而SESN2+ miR-34a mimic組細(xì)胞的凋亡率及上述相關(guān)蛋白表達(dá)均無明顯差異(P>0.05)；但與SESN2組相比，SESN2+miR-34a mimic組細(xì)胞的凋亡率及促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)明顯升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2及AMPK信號通路相關(guān)蛋白AMPK磷酸化水平及SIRT1表達(dá)水平均明顯降低(均P<0.05)，見圖3。

2.4 miR-34a靶向調(diào)控SESN2參與影響HEI-OC1細(xì)胞氧化損傷 與NC組相比，SESN2組細(xì)胞能顯著促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞中SOD、CAT及GSH-Px表達(dá)，并減少M(fèi)DA表達(dá)(均P<0.05)，SESN2+miR-34a mimic組細(xì)胞中SOD、CAT及GSH-P表達(dá)均無明顯變化(P>0.05)；而與SESN2細(xì)胞相比，SESN2+miR-34a mimic組細(xì)胞中SOD、CAT及GSH-P表達(dá)均明顯降低，但MDA表達(dá)量顯著增加(均P<0.05)，見表2。

圖3 miR-34a靶向SESN2促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞凋亡

表2 miR-34a靶向SESN2參與調(diào)控HEI-OC1細(xì)胞氧化應(yīng)激水平

3 討論

SESN2蛋白是應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白SESNs家族的重要成員，最初被發(fā)現(xiàn)確定為p53靶基因[11-12]，發(fā)揮維持代謝、增強(qiáng)自噬及調(diào)控細(xì)胞增殖等生物學(xué)作用，特別是在代謝及年齡相關(guān)性疾病中，胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生、發(fā)展都與SESN2對脅迫免疫響應(yīng)和炎癥激活有著或多或少的關(guān)系[13-14]。同時隨著研究的不斷深入，SESN2活化參與介導(dǎo)的下游AMPK/TSC2/mTOR、PERK/ERS、Nrf2-ARE等多種信號通路的激活及分子調(diào)控機(jī)制被不斷揭示[15-17]，而SESN2的表達(dá)抑制及應(yīng)激條件激活又受到何種分子或信號的調(diào)控尚未完全闡明。因此，本研究驗(yàn)證了SESN2與miR-34a在HEI-OC1細(xì)胞中的相互作用關(guān)系，并初步揭示了兩者在耳蝸毛細(xì)胞凋亡中作用及機(jī)制。

通過構(gòu)建雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)染HEK293T模式細(xì)胞驗(yàn)證miR-34a與SESN2 3′UTR區(qū)靶向結(jié)合可能，證明SESN2與miR-34a存在穩(wěn)定結(jié)合序列，且在定點(diǎn)突變該結(jié)合序列后miR-34a mimic不能結(jié)合并阻斷螢光素酶表達(dá)。進(jìn)一步驗(yàn)證兩者在HEI-OC1細(xì)胞中的的表達(dá)相關(guān)性，本研究采用HEI-OC1細(xì)胞相較于原代提取的體內(nèi)毛細(xì)胞具有一定的永生化能力，在包括AHL等多種聽覺相關(guān)疾病研究模型中得到廣泛應(yīng)用，結(jié)果顯示SESN2與miR-34a在HEI-OC1細(xì)胞中的表達(dá)水平存在相互拮抗，miR-34a的過表達(dá)能夠顯著抑制SESN2 mRNA的轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞內(nèi)SESN2蛋白的生成。以上結(jié)果顯示，miR-34a靶向結(jié)合并抑制SENS2的表達(dá)，其機(jī)制可能與miR-34a靶向結(jié)合SESN2并指導(dǎo)基因沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)[18]實(shí)現(xiàn)對SENS2 mRNA的降解及翻譯抑制有關(guān)。

隨后通過CCK-8、細(xì)胞凋亡及ELISA等方法檢測miR-34a靶向SESN2對HEI-OC1細(xì)胞體外增殖、凋亡及氧化損傷等方面的影響，結(jié)果顯示過表達(dá)SESN2能夠顯著促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡并提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激水平，反之過表達(dá)miR-34a則會削弱SESN2對HEI-OC1細(xì)胞的保護(hù)作用。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-34a高表達(dá)于AHL患者中，并能夠通過抑制SIRT1表達(dá)參與介導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞凋亡[19]，同時研究發(fā)現(xiàn)在小鼠年齡相關(guān)性耳聾模型中，隨著年齡的增加SESN2的表達(dá)隨之減少[20]，且SESN2蛋白參與的自噬及凋亡調(diào)控被證實(shí)與SIRT1/AMPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)[21-22]，這提示在耳蝸毛細(xì)胞相關(guān)分子損傷中miR-34a的表達(dá)增加可能通過靶向抑制SESN2激活，減少應(yīng)激蛋白表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至凋亡。因此，本研究進(jìn)一步檢測了細(xì)胞內(nèi)p-AMPK、AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)變化及SESN2相關(guān)抗氧化損傷因子表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與NC組相比，過表達(dá)SESN2能顯著促進(jìn)SIRT1、p-AMPK/AMPK蛋白相對表達(dá)量增加，細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激因子SOD、CAT及GSH-Px表達(dá)量隨SESN2增加而升高，提示SESN2可能通過調(diào)控AMPK/SIRT1信號通路降低HEI-OC1細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，提高細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡，反之共轉(zhuǎn)染miR-34a mimic抑制SESN2的表達(dá)進(jìn)而抑制了細(xì)胞內(nèi)SIRT1、p-AMPK/AMPK、SOD、CAT及GSH-Px蛋白的表達(dá)，促進(jìn)MDA表達(dá)，最終造成細(xì)胞氧化損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這提示，miR-34a靶向SENS2參與介導(dǎo)AMPK/SIRT1信號通路表達(dá)調(diào)控并促進(jìn)耳蝸毛細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，miR-34a能通過靶向抑制SENS2表達(dá)，促進(jìn)AMPK/SIRT1信號通路激活、抑制細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激因子SOD、CAT及GSH-Px表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞氧化損傷，miR-34a靶向SENS2對HEI-OC1細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。