文立楊，程為平，程光宇，張奇，王軒

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

作為臨床上常見的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，癲癇主要因腦神經(jīng)元異常放電引起。流行病學(xué)資料顯示[1],我國癲癇患者約900萬人，每年新增70多萬例,50%以上患者有認知功能障礙,嚴重危害生命健康。研究表明[2]，針灸有通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡達到治療相關(guān)病癥的作用。電針(electroacupuncture，EA)是針刺得氣后針柄聯(lián)接電針治療儀，給予微量生物電流波，使針感持續(xù)的方法。本研究通過觀察電針“百會”“腰奇”對PTZ致癇大鼠行為學(xué)及腸道菌群豐度的變化,基于腸道菌群探討電針的抗癇作用機制?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

24只SPF級雌性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量200～250 g,黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號: SYXK(黑)2019-004。實驗室濕度控制在45%～60%, 溫度控制在17～24 ℃。在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后, 將大鼠編號、稱重, 用計算機生成的隨機數(shù)字表選取其中8只作為空白組(N組),余16只在戊四氮點燃模型成功后平均分為模型組(M組)和電針組(E組)。

1.2 實驗試劑與儀器

戊巴比妥鈉(Pentetrazol-PTZ,美國Sigma公司,貨號:Sigma-p6500-25G)配制成戊四氮溶液(PTZ溶液,濃度:2 mg/mL);10%水合氯醛溶液(天津市大茂化學(xué)試劑廠);SDZ-Ⅱ電針治療儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司);0.18 mm×13 mm華佗牌毫針;-80 ℃立式超低溫冰箱(DW-86L8281型,Haier公司);Hiseq測序儀(Illumina公司)。

1.3 造模方法

每天選取固定時間(8:00—10:00 AM),除空白組大鼠外,剩余16只大鼠腹腔注射PTZ(35 mg/kg),空白組給予腹腔注射等劑量的0.9% NaCl注射液,觀察大鼠的行為學(xué)變化并記錄Ravine分級[3]。0級:大鼠正常無抽搐發(fā)作；Ⅰ級:大鼠僅面部抽動;Ⅱ級:大鼠出現(xiàn)濕狗樣點頭抖動;Ⅲ級:單側(cè)前肢陣攣性發(fā)作;Ⅳ級:大鼠前肢陣攣抬起伴站立;Ⅴ級:大鼠全面發(fā)作伴站立及跌倒。模型制備周期為28 d,至少連續(xù)3次不低于Ⅵ級的發(fā)作即認為造模成功。在造模過程中,若大鼠持續(xù)Ⅴ級發(fā)作超過5 min不能停止，應(yīng)當立即給予腹腔注射10%的水合氯醛(5 mg/kg)干預(yù),防止死亡。

1.4 干預(yù)方法

造模成功后,每組予以相應(yīng)的干預(yù)治療。其中,空白組和模型組大鼠除每天固定時間(08:00—11:00 AM)用保定器固定10 min外,不給予其他干預(yù)。電針組大鼠于每天相同時間保定器固定,針刺“百會”“腰奇”,取穴參照《實驗針灸學(xué)》[4],其中“百會”向后平刺2 mm;“腰奇”向前平刺1.3 mm;針刺完畢將電針治療儀的正極連接在百會穴針柄上,負極連接在腰奇穴針柄上,給予頻率100 Hz的連續(xù)波,根據(jù)大鼠耐受程度選擇電針治療儀的強度,每天治療10 min,連續(xù)治療14 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠一般情況

觀察大鼠的一般狀態(tài), 如精神狀況、反應(yīng)速度、體質(zhì)量、進食、毛發(fā)等。

1.5.2 全面強直陣攣發(fā)作(GTCS)和極小陣攣發(fā)作(MCS)潛伏期

連續(xù)治療14 d, 根據(jù)Racine分級,觀察各組大鼠GTCS潛伏期和MCS潛伏期。

1.5.3 Morris水迷宮實驗

各組大鼠第14天的治療結(jié)束后，分別進行Morris水迷宮實驗，以評估各組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力情況。水迷宮實驗由定位航行和空間探索兩個實驗構(gòu)成，共進行6 d。首先進行定位航行實驗，共5 d,每天上午2次,下午2次,每次實驗開始從Ⅰ～Ⅳ任意象限的固定位置將大鼠面向水池壁放入池中,記錄最后一天大鼠的逃避潛伏期，即從大鼠進入水中開始直到其找到水中平臺并爬上平臺的時間?？臻g探索實驗在第6日進行，將水迷宮中的平臺撤除，使每組大鼠從同一象限的同一位點進入水中，記錄SD大鼠在120 s內(nèi)為搜索平臺而穿越原平臺所在象限的次數(shù)。

1.5.4 腸道菌檢測

利用16srDNA測序技術(shù)檢測腸道菌群。14 d的治療結(jié)束后，對各組大鼠糞便進行搜集,具體方法：將經(jīng)過紫外線殺菌的清潔用紙置于鼠盒內(nèi),每只大鼠在鼠盒中自然排便后,收集3～4粒無污染的糞便放置于EP管中,快速放入液氮中速凍以防止降解,放入-80 ℃冰箱待用。測序具體流程如下,①DNA的提取:使用PowerSoilR DNA分離試劑盒，從糞便樣本中提取DNA;②PCR的擴增:用滅菌水將提取的糞便樣品的DNA稀釋至1 ng/μL,稀釋所得DNA為模版,靶標為糞便中的細菌16srRNA，其中的v3-v4高可變區(qū)序列,擴增后得PCR產(chǎn)物;③測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測濃度、純度后經(jīng)純化,最后使用試劑盒對PCR產(chǎn)物Qubit定量,基因組測序由Ⅰ llumina Hiseq測序平臺完成;④數(shù)據(jù)處理：設(shè)置序列的相似性閾值為97%進行OTU聚類,其中OTU是根據(jù)相似性進行分組的操作分類單元，使用Userach對嵌合體序列進行鑒定并移除。因每個OTU均有1個有代表性的序列，故可利用Silva Classifer分類數(shù)據(jù)庫對每個代表性序列進行對應(yīng)的物種注釋。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

空白組(N組)大鼠精神狀況良好,反應(yīng)靈敏、毛發(fā)泛有光澤，食量正常。與空白組比較，模型組(M組)大鼠表現(xiàn)為反應(yīng)遲緩、毛發(fā)暗黃、攝食減少、體質(zhì)量增長緩慢,易受激惹。電針組(E組)大鼠整體狀態(tài)改善,與模型組相比,反應(yīng)漸靈活,毛發(fā)潤澤,食量漸增,大發(fā)作次數(shù)減少,持續(xù)時間明顯縮短。

2.2 GTCS和MCS潛伏期

E組GTCS潛伏期明顯較M組延長(P<0.05)；N組大鼠未見癲癇發(fā)作。與M組相比,E組MCS潛伏期明顯延長(P<0.05)。N組大鼠未見癇性發(fā)作。詳見表1。

表1 各組大鼠GTCS和MCS潛伏期比較

2.3 Morris水迷宮實驗

與N組相比,M組大鼠的逃避潛伏期明顯延長,穿越平臺次數(shù)明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與M組比較,E組逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),逃避潛伏期較M組明顯變短,穿越平臺次數(shù)較M組增多。詳見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較

2.4 Alpha多樣性分析

16srDNA測序中3組大鼠的糞便樣本，經(jīng)質(zhì)控后每個樣本獲得50 818條有效序列，長度平均417～429。觀察初步隨機抽樣構(gòu)建的稀釋曲線 (見圖1和圖2)可發(fā)現(xiàn)，曲線隨著測序數(shù)據(jù)量增加而趨于平緩，即每個樣本的物種數(shù)量(Sobs)不會隨之繼續(xù)增加，說明目前的測序深度基本能覆蓋大鼠糞便樣品中的微生物種類，本研究所有樣本序列充分。

圖1 M組和N組Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線圖

圖2 E組和M組Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線圖

2.5 Beta多樣性分析

N與M組大鼠腸道菌群PCoA得分圖(見圖3)顯示,樣本組成差異的PC1貢獻度為24.35%，PC2為20.40%。兩組數(shù)據(jù)無論是密度還是空間距離均不相同，說明兩組樣本完全分開，結(jié)合Adonis非參數(shù)分析，得到P=0.006<0.05，R2=0.146，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。E組與M組大鼠腸道菌群PCoA得分圖(見圖4)顯示,樣本組成差異的PC1貢獻度為25.42%，PC2為15.78%。同時結(jié)合Adonis分析得到P=0.002<0.05，R2=0.164，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。可見M組較N組大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，而電針可促進恢復(fù)腸道菌群組成結(jié)構(gòu)。

圖3 M組和N組大鼠腸道菌群PCoA平面圖

圖4 E組和M組大鼠腸道菌群PCoA平面圖

2.6 組間差異分析

通過LEfSe分析各豐度間差異的影響，找到顯著差異影響的菌群。LEfSe進化樹圖中的每個圓圈代表該水平的一個分類，圓圈大小與豐度呈正比，從內(nèi)到外分別代表門至種的分級；不同顏色代表不同組別，相同顏色的節(jié)點表示在組中顯著富集，并對組間差異有顯著影響的菌群;若在兩組中均無顯著差異的微生物類群則用黃色節(jié)點表示。結(jié)果,在電針組中豐度顯著下調(diào)的菌群有5個為普雷沃氏菌科、普雷沃氏菌屬-9、擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目，而普雷沃氏菌_NK3B31在模型組內(nèi)顯著下降，以聚類樹體現(xiàn)結(jié)果，見圖5和圖6。

圖5 M組LEfSe多級物種層級樹圖

圖6 E組和N組LEfSe多級物種層級樹圖

2.7 門水平下的菌群差異

通過對各組大鼠門水平分類下不同菌群的豐度進行比較發(fā)現(xiàn),與N組相比,M組大鼠疣微菌門豐度升高、螺旋體門豐度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；門水平分類下E組與M組相比，疣微菌門和擬桿菌門豐度明顯降低(P<0.05)。詳見表3、圖7和圖8。

表3 各組大鼠門水平下不同菌群的豐度比較

圖7 E組和N兩組門水平菌落bar圖

3 討論

癲癇是一種反復(fù)發(fā)作的慢性腦病，可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆的損害，無論對患者的認知功能還是對其家庭的生活質(zhì)量都有極大影響[5]。本實驗采用戊四氮點燃大鼠模型，可以較好的模擬癲癇發(fā)作易反復(fù)的特點[6]。應(yīng)用水迷宮實驗因其可較好的觀察大鼠行為學(xué)變化，并反映其認知功能。干預(yù)方法選用電針，因在癲癇治療方面，針灸療效顯著、安全性高、價格低廉，電針在針灸的基礎(chǔ)上給予電流刺激，可使針感持續(xù)[7]。針灸治療癲癇歷史悠久，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有關(guān)于針灸治療癲癇的記載。實驗中針刺“百會”“腰奇”因癲癇病位在腦，而督脈上行入絡(luò)腦，故治癇首選督脈。百會穴位于頭頂，有溝通陰陽脈絡(luò)、清利頭目、醒腦開竅的作用，百會穴的使用體現(xiàn)了腧穴的近治作用；腰奇穴位于腰骶, 為經(jīng)外奇穴, 有振奮陽氣、疏調(diào)督脈的作用,為治療癲癇的要穴。兩穴上下溝通，共奏補腦益髓、抵御外邪、定癇開竅的作用?，F(xiàn)代研究表明[8]，百會與腰奇配伍，可有效延長大鼠的驚厥潛伏期、同時增加海馬中NO的含量、增強NOS及SOD的活性。柳成剛等[9]研究發(fā)現(xiàn),針刺百會與腰奇可降低PTZ致癇大鼠血清IL-1β表達、升高IL-6的表達,減輕海馬神經(jīng)元的損傷程度。前期實驗發(fā)現(xiàn)[10]，電針“百會”“腰奇”能有效降低PTZ癲癇大鼠腦電的振幅，升高Beta、Gamma的主頻率,延長癲癇發(fā)作潛伏期。此外，有研究表明[11]，針刺可通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)及腦腸肽含量在疾病的預(yù)防及恢復(fù)中起關(guān)鍵作用。本研究通過PTZ誘導(dǎo)建立慢性癲癇模型，以電針為干預(yù)手段，選“百會”“腰奇”常用抗癇穴，分析電針對癲癇模型大鼠的行為學(xué)及腸道菌群的影響，并基于腸道菌群的角度探討電針的抗癇機制。

研究顯示[12]，癲癇的發(fā)生與腸道菌群關(guān)系密切。腸道菌群可以通過免疫途徑參與癲癇的發(fā)生，這可能與腸道微生物產(chǎn)生的色氨酸代謝物影響轉(zhuǎn)化生長因子 α(transforming growth factor-α,TGFα)和血管內(nèi)皮生長因子-β(vascular endothelial growth factor -β,VEGF-β)的產(chǎn)生，從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)炎癥有關(guān)[13]。此外，腸道菌群還可以通過影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成及代謝參與癲癇發(fā)病，研究表明[14]腸道微生物結(jié)構(gòu)因生酮飲食干預(yù)而發(fā)生改變，提高海馬GABA/glu比值，預(yù)防癲癇發(fā)作。腸道中菌群可分為腸道中大量存在，和消化功能相關(guān)的優(yōu)勢菌群，與數(shù)量少和消化功能不密切的劣勢菌群。 另有研究發(fā)現(xiàn)[15]，大鼠腸道中的優(yōu)勢門菌群為厚壁菌門、擬桿菌門，其中，擬桿菌門是腸道中一種常在菌群，厚壁菌門多為革蘭陽性菌，是細菌的高級分類單元，其細胞壁厚度約10～50 nm，有細胞壁結(jié)構(gòu)。作為腸道的優(yōu)勢菌種，兩者可通過維持腸道菌群的平衡和穩(wěn)定，使腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能完整[16]。有研究表明[17],消化性潰瘍患者，腸道菌群存在優(yōu)勢菌群比例失調(diào)的情況，與變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等菌門相關(guān)。 Kelly等[18]也發(fā)現(xiàn)腸道菌群多樣性越高，菌群的分布越均勻，機體免疫功能水平越穩(wěn)定，其機制可能與肥大細胞的功能相關(guān)。

針灸對腸道菌群有調(diào)節(jié)作用[19],本次實驗發(fā)現(xiàn)，各組大鼠的糞便樣本中門水平菌群情況基本一致，優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門，這與前人的研究[15]結(jié)果一致。模型組大鼠和空白組相比,厚壁菌門為升高趨勢,擬桿菌門為降低趨勢，未出現(xiàn)優(yōu)劣勢菌群倒置，但在門分類下模型組大鼠的腸道總微生物群落減少?？梢娫诎d癇發(fā)作時，雖然降低了優(yōu)勢菌群比例但優(yōu)勢菌群不變，這與優(yōu)勢菌門能對抗癲癇發(fā)作時的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，擬桿菌門出現(xiàn)降低趨勢因其較厚壁菌門更容易受到癲癇的干擾。上述變化與模型組行為學(xué)結(jié)果一致，在Morris水迷宮實驗中發(fā)現(xiàn)，模型組表現(xiàn)出逃避潛伏期較空白組長，且穿越平臺的次數(shù)減少，說明戊四氮造模后大鼠的認知功能發(fā)生障礙，以記憶及空間學(xué)習(xí)能力下降為主。結(jié)合β多樣性 PCoA 分析，相互聚集的樣本其群落組成和結(jié)構(gòu)相似度高，可視化后距離也接近，與空白組相比模型組有樣本出現(xiàn)了離群，說明與正常狀態(tài)相比癲癇時，群落的結(jié)構(gòu)改變，體現(xiàn)了擬桿菌門的降低趨勢。與模型組相比，電針組大鼠數(shù)的逃避潛伏期縮短、平臺穿越次數(shù)增多，提示電針能改善癲癇大鼠的認知功能，保護神經(jīng)元，與以往研究[8-9]結(jié)果相一致。電針干預(yù)后大鼠的厚壁菌門趨勢升高、擬桿菌門為降低趨勢，雖然兩者均為未達到正常組比例，但仍為優(yōu)勢菌群。結(jié)合β多樣性 PCoA 分析，與模型組對比，電針組樣本群落聚集在NMDS1負向且具有明顯的差異性，兩組間差異離散趨勢明顯，說明電針干預(yù)可以在一定程度上改善腸道菌群失衡，促進癲癇后的修復(fù)。

綜上所述，本實驗通過觀察大鼠行為學(xué)改變、腸道菌群結(jié)構(gòu)豐度的變化，表明電針“百會”“腰奇”對癲癇模型大鼠有較好的抗癇效果，其機制可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)得到調(diào)節(jié)和恢復(fù)有關(guān)。