梁學(xué)威，苑海剛，于天一

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著人民群眾生活水平的日益提高，我國人口的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大改變，伴隨著這些改變，糖尿病發(fā)病率逐年增高，據(jù)統(tǒng)計，我國糖尿病發(fā)病率從1980年的不足1%，發(fā)展到2010年的超過10%，近年來還有進(jìn)一步上升的勢頭[1]。

皮膚是糖尿病這個多系統(tǒng)疾病的一個復(fù)雜的靶器官。糖尿病患者因周圍神經(jīng)病變與外周血管疾病合并外來的機(jī)械壓力，可引起軟組織破壞，進(jìn)而引發(fā)一系列問題，從輕度的神經(jīng)癥狀、血管疾病到嚴(yán)重的潰瘍、感染。根據(jù)Wrobel J S及Alavi A等的研究，糖尿病患者一生中有15%～25%的幾率發(fā)生糖尿病性潰瘍，一旦發(fā)生，創(chuàng)面遷延不愈，在經(jīng)有效醫(yī)學(xué)干預(yù)的條件下，5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)50%～70%，糖尿病患者因糖尿病性潰瘍所導(dǎo)致的截肢率是普通人群的15倍以上[2-3]。該類截肢是目前非創(chuàng)傷截肢的主要原因之一。Pinto A等在其研究中認(rèn)為,糖尿病性潰瘍患者截肢后的病死率也明顯升高，術(shù)后5年內(nèi)的病死率高達(dá)70%[4]。

西醫(yī)治療該病常用以下方案：①代謝管理治療，包括胰島素或胰島素聯(lián)合其他藥物等；②改善局部供血治療，包括擴(kuò)張血管藥物、抗血小板及抗凝藥物等；③手術(shù)治療，包括下肢動脈腔內(nèi)介入治療(球囊擴(kuò)展及支架等)、下肢動脈旁路移植等；④抗感染及抗炎治療，包括應(yīng)用各類抗生素等；⑤其他對癥支持，包括止痛等[5-7]。但到目前為止，本病治療方法沒有取得更進(jìn)一步的突破。

近年來越來越多的研究指出，從目前的臨床實踐和研究進(jìn)展來看，中醫(yī)藥治療糖尿病性潰瘍顯現(xiàn)出一定的優(yōu)勢[8-9]。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院趙鋼教授經(jīng)過長期的臨床經(jīng)驗積累，創(chuàng)制了外用中藥湯劑——瘡瘍Ⅰ號，用于糖尿病性潰瘍的治療，已經(jīng)在臨床工作中獲得較好的效果。本研究觀察該方外敷對大鼠糖尿病性潰瘍的影響，旨在進(jìn)一步驗證其有效性。

1 實驗材料與實驗方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠(南京君科生物科技有限公司)，選取1月齡，體質(zhì)量(100±20)g，共30只。

1.2 分組方法

隨機(jī)分成6組，每組各5只，將各組分別命名為：實驗1組(A1組)、實驗2組(A2組)、對照1組(B1組)、對照2組(B2組)、空白1組(C1組)和空白2組(C2組)。將A1、A2、B1、B2等4組，合計20只，進(jìn)行建模；C1、C2等2組，合計10只,不建模。

1.3 飼養(yǎng)與建模

1.3.1 飼養(yǎng)條件

大鼠進(jìn)食采用江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的實驗用鼠60%脂肪供能高脂飼料，自由采食及飲水，室內(nèi)自然晝夜照明，通風(fēng)良好，室溫18～23 ℃，相對濕度55%～75%。以該高脂飼料飼養(yǎng)4周。

1.3.2 糖尿病模型制備

禁食12 h，不禁水，4 ℃檸檬酸鈉(北京酷來搏科技有限公司)緩沖液(0.1 mol/L，pH=4.5)稀釋STZ (北京酷來搏科技有限公司)，35 mg/kg 一次性腹腔注射。72 h后使用血糖儀測量大鼠尾尖血糖，以隨機(jī)血糖持續(xù)>16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。每2周測量一次尾尖血糖，隨機(jī)血糖<16.7 mmol/L的大鼠予以剔除，對于血糖>27.0 mmol/L的大鼠，予精蛋白鋅胰島素注射液2 u，每日1次皮下注射，以保持糖尿病大鼠血糖水平穩(wěn)定，從而排除血糖因素的影響并降低糖尿病大鼠的病死率。

1.3.3 糖尿病性潰瘍模型制備

糖尿病大鼠飼養(yǎng)4周后，使用3%的戊巴比妥鈉(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)溶液腹腔注射，使其麻醉，置仰臥位，用橡皮筋將其固定于手術(shù)板上。將糖尿病大鼠麻醉后背部備皮，作直徑2.0 cm的圓形標(biāo)記，在無菌條件下，用砂紙磨去標(biāo)記處全層皮膚，并深達(dá)筋膜，形成創(chuàng)面，止血后充分暴露48 h，即成糖尿病性潰瘍大鼠模型。

1.4 瘡瘍Ⅰ號藥劑制備

選用黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局提供的飲片進(jìn)行藥物制備，飲片符合《中華人民共和國藥典》2020版相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。組方：連翹100 g，黃芩50 g，赤芍30 g，當(dāng)歸30 g,苦參30 g。共5味，飲片加水2 000 mL浸泡24 h，武火煮沸后改用文火煎煮120 min，用紗布濾出煎液保存?zhèn)溆茫偌铀? 000 mL，同法煎煮，用紗布濾出煎液保存?zhèn)溆?。?次煎液均勻混合，減壓濃縮至50 mL，置于4 ℃冰箱保存。外用前提前取出藥液，放置至常溫后使用。

1.5 治療方法

實驗組(A1、A2組)：均局部應(yīng)用中藥瘡瘍Ⅰ號無菌紗條外敷、無菌紗布包扎、塑料薄膜外包。

對照組(B1、B2組):無菌紗條外敷、無菌紗布包扎、塑料薄膜外包。

空白組(C1、C2組):不建模，僅進(jìn)行麻醉及足部備皮，用無菌紗條外敷、無菌紗布包扎、塑料薄膜外包。

所有大鼠均每2日換藥1次。

1.6 創(chuàng)面宏觀指標(biāo)

觀察潰瘍治療前后的面積差異，共進(jìn)行2次，于治療第15天和第30天分別測量，第15天測量A1、B1、C1組，第30天測量A2、B2、C2組。

方法：到達(dá)規(guī)定日期后，乙醚麻醉大鼠，使用透明薄膜覆蓋于創(chuàng)面表面，在薄膜表面用藍(lán)色記號筆延創(chuàng)面外緣進(jìn)行標(biāo)記，取下薄膜，則得創(chuàng)面輪廓線。再將該薄膜覆蓋于方格紙上，計取輪廓線內(nèi)方格數(shù)，使用方格計數(shù)法求得面積(C組無創(chuàng)面，數(shù)值為0)。

1.7 超敏C-反應(yīng)蛋白水平

觀察潰瘍治療前后的血液超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平。共進(jìn)行2次，于治療后的第15天和第30天測量，第15天測量A1、B1、C1組，第30天測量A2、B2、C2組。方法：①使用已在前一步中麻醉并計取創(chuàng)面面積的大鼠。②取尾尖血后，使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司)，測得超敏C-反應(yīng)蛋白水平。

1.8 創(chuàng)面炎性因子指標(biāo)

觀察潰瘍治療前后的創(chuàng)面促炎因子水平，包括促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18)和抑炎因子(IL-4、IL-10)。共進(jìn)行2次，于治療后的第15和第30天測量，第15天測量A1、B1、C1組，第30天測量A2、B2、C2組。方法：①將已在前一步中采集尾尖血后的大鼠處死。②使用組織鉗夾取創(chuàng)面邊界組織(C1、C2組取背部包扎部位皮下組織)。③使用ELISA標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，測得相應(yīng)炎癥因子指標(biāo)。

1.9 創(chuàng)面組織中NF-κB通路指標(biāo)

觀察潰瘍治療前后NF-κB蛋白表達(dá)水平。共進(jìn)行2次，于治療后的第15天和第30天測量，第15天測量A1、B1、C1組，第30天測量A2、B2、C2組。方法：①使用前一步中取得的組織。②稱取約100 mg，加入RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)200 mL，蛋白酶抑制劑PMSF(北京酷來搏科技有限公司)6 μL。③充分勻漿，以3 000 r/min離心20 min，吸取上清，即得蛋白質(zhì)。④每個樣品取30 μg總蛋白上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)膜70 min (電壓為110 V)，5%脫脂奶粉封閉3 h，一抗孵育過夜(NF-κB-p65為 1∶1 000，β-actin為1∶1 000)，TBST洗膜3次，相對應(yīng)羊抗兔二抗孵育1 h，ECL法顯影(試劑均來自南京森貝伽生物科技有限公司)。⑤采用Quantity One軟件對蛋白條帶進(jìn)行結(jié)果分析。

NF-κB蛋白相對表達(dá)量=NF-κB-p65蛋白的灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面宏觀指標(biāo)比較

治療第15天和第30天，C組(包括C1、C2)未建模，健康無異常。A組(包括A1、A2)潰瘍面積均有縮小。 A1與B1比較，A2與B2比較，潰瘍面積縮小均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示，瘡瘍Ⅰ號外敷能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合，減小創(chuàng)面面積。各階段各組創(chuàng)面面積如表1所示。

表1 各階段各組創(chuàng)面面積比較

2.2 臨床炎癥指標(biāo)比較

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2組比較，臨床炎癥指標(biāo)(hs-CRP)均升高(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，臨床炎癥指標(biāo)降低均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示，瘡瘍Ⅰ號外敷能夠在一定程度上降低臨床炎癥指標(biāo)(hs-CRP)，控制機(jī)體炎癥水平。各組hs-CRP水平如表2所示。

表2 各組hs-CRP水平比較

2.3 創(chuàng)面促炎因子指標(biāo)比較

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2比較，創(chuàng)面組織促炎因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18)水平均升高(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，創(chuàng)面組織促炎因子水平下降均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示，瘡瘍Ⅰ號外敷能夠在一定程度上降低創(chuàng)面局部促炎因子水平，抑制組織炎癥。各組促炎因子水平如表3所示。

表3 治療第15天和第30天各組促炎因子水平比較

2.4 創(chuàng)面抑炎因子指標(biāo)比較

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2組比較，創(chuàng)面組織IL-4水平均有降低(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，IL-4水平升高均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2組比較，創(chuàng)面組織IL-10水平均有升高(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，IL-10水平升高均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示：瘡瘍Ⅰ號外敷能夠在一定程度上提高創(chuàng)面局部抑炎因子水平，抑制組織炎癥。各組促炎因子水平如表4所示。

表4 治療第15天和第30天各組抑炎因子水平比較

2.5 創(chuàng)面組織中NF-κB-p65蛋白表達(dá)水平的比較

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2組比較，NF-κB-p65蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，創(chuàng)面NF-κB-p65蛋白表達(dá)水平下降均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示，瘡瘍Ⅰ號外敷能夠在一定程度上降低創(chuàng)面局部組織中NF-κB-p65蛋白的表達(dá)水平，抑制NF-κB通路，抑制炎癥反應(yīng)。各組NF-κB-p65蛋白的表達(dá)水平如表5所示。

表5 治療第15天和第30天各組NF-κB-p65蛋白的表達(dá)水平比較

3 討論

瘡瘍Ⅰ號組方為連翹100 g,黃芩50 g,赤芍30 g,當(dāng)歸30 g,苦參30 g，共5味。方中連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，在本方中清熱解毒，攻創(chuàng)面之毒，取邪去則正安之意，為君藥。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，輔助連翹，進(jìn)一步增強(qiáng)清熱解毒之功效，為臣藥。赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛之功效，在本方中一方面協(xié)助連翹、黃芩清熱，另一方面涼血化瘀，解除瘀阻，恢復(fù)局部血脈運(yùn)行，為佐藥。當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血之功效，與赤芍合用，成活血化瘀之勢，調(diào)理血脈，使血行通暢以養(yǎng)筋肉，為佐藥?？鄥⒕哂星鍩嵩餄裰πВ环矫鎱f(xié)助連翹、黃芩、赤芍以清熱，另一方面燥濕創(chuàng)面，使腐肉得生，為佐藥。諸藥合用，以清熱解毒、活血化瘀為基本治法，針對糖尿病性潰瘍患者局部最常見的濕熱下注之證進(jìn)行治療。

從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度看，連翹具有降低NF-κB-p65表達(dá)，同時使MCP-1和IL-6表達(dá)水平下降的作用[10-14]。黃芩中的有效成分——黃芩素,可以通過減輕腎臟細(xì)胞炎癥來延緩糖尿病腎病的進(jìn)展，且與抑制炎癥信號NF-κB通路的激活密切相關(guān)[15-19]。當(dāng)歸中的有效成分——當(dāng)歸多糖,可顯著改善糖尿病神經(jīng)病變大鼠的周圍神經(jīng)損傷狀態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)的恢復(fù)，其機(jī)制可能與阻斷NF-κB信號路徑的傳導(dǎo)，降低炎性因子水平，減輕神經(jīng)的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[20-22]。

由上述內(nèi)容可以導(dǎo)出，瘡瘍Ⅰ號應(yīng)用于大鼠糖尿病性潰瘍時所表現(xiàn)出的治療作用，可能與其抑制了NF-κB-p65蛋白的表達(dá)水平，抑制NF-κB信號通路，進(jìn)而在降低了創(chuàng)面局部促炎因子水平的同時提高了抑炎因子的水平，最終抑制了炎癥水平有關(guān)。

本實驗結(jié)果中，實驗組與對照組比較，潰瘍面積縮小、臨床炎癥指標(biāo)降低、創(chuàng)面組織促炎因子水平下降、創(chuàng)面抑炎因子水平升高均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，創(chuàng)面NF-κB-p65蛋白表達(dá)水平下降方面均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。分別在宏觀層面、臨床指標(biāo)層面、細(xì)胞因子層面、核因子蛋白層面驗證了上述假設(shè)。

綜上所述，應(yīng)用瘡瘍Ⅰ號外敷，能夠在一定程度上促進(jìn)糖尿病性潰瘍的創(chuàng)面愈合，具體表現(xiàn)為治療前后局部創(chuàng)面面積的縮小、局部組織促炎因子水平降低、抑炎因子水平升高、血清hs-CRP降低。其機(jī)制可能與組方藥物中的有效成分抑制了NF-κB信號通路有關(guān)，但具體治療機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。